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"METABOLOMICS WORKBENCH":{"STUDY_ID":"ST003053","ANALYSIS_ID":"AN005006","VERSION":"1","CREATED_ON":"01-25-2024"},

"PROJECT":{"PROJECT_TITLE":"Providing insight into the mechanism of action of Cationic Lipidated Oligomers (CLOs) using metabolomics","PROJECT_TYPE":"Biomedical research","PROJECT_SUMMARY":"The increasing resistance of clinically relevant microbes against current commercially available antimicrobials underpins the urgent need for alternative and novel treatment strategies. Cationic lipidated oligomers (CLOs) are innovative alternatives to antimicrobial peptides, and have reported antimicrobial potential. An understanding of their antimicrobial mechanism of action is required to rationally design future treatment strategies for CLOs, either in monotherapy or synergistic combinations. In the present study, metabolomics was used to investigate the potential metabolic pathways involved in the mechanisms of antibacterial activity of one CLO, C12-o-(BG-D)-10, which we have previously shown to be effective against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) ATCC 43300. The metabolomes of MRSA ATCC 43300 at 1, 3 and 6 h following treatment with C12-o-(BG-D)-10 (48 µg/mL i.e., 3x MIC) were compared to those of the untreated controls. Our findings reveal that the studied CLO, C12-o-(BG-D)-10, disorganized the bacterial membrane as the first step towards its antimicrobial effect, as evidenced by marked perturbations in the bacterial membrane lipids and peptidoglycan biosynthesis observed at early time points i.e., 1, and 3 h. Central carbon metabolism, and biosynthesis of DNA, RNA, and arginine were also vigorously perturbed, mainly at early time points. Moreover, bacterial cells were under osmotic and oxidative stress across all time points, evident by perturbations of trehalose biosynthesis and pentose phosphate shunt. Overall, this metabolomics study has, for the first time, revealed that the antimicrobial action of C12-o-(BG-D)-10 may potentially stem from the dysregulation of multiple metabolic pathways.","INSTITUTE":"Monash University","DEPARTMENT":"Monash Institute of Pharmaceutical Sciences","LABORATORY":"Cornelia Landersdorfer","LAST_NAME":"Hussein","FIRST_NAME":"Meytham","ADDRESS":"Monash University, Clayton, Victoria 3800, Australia","EMAIL":"maytham.hussein.old@monash.edu","PHONE":"+61448671141","PUBLICATIONS":"Providing insight into the mechanism of action of Cationic Lipidated Oligomers (CLOs) using metabolomics","DOI":"http://dx.doi.org/10.21228/M8VQ65","CONTRIBUTORS":"Maytham Hussein, Muhammad Bilal Hassan Mahboob, James L. Grace, Jessica R. Tait, Véronique Montembault, Laurent Fontaine, John F. Quinn, Tony Velkov, Michael R. Whittaker, Cornelia B. Landersdorfer"},

"STUDY":{"STUDY_TITLE":"Providing insight into the mechanism of action of Cationic Lipidated Oligomers (CLOs) using metabolomics","STUDY_TYPE":"Biomedical research","STUDY_SUMMARY":"The increasing resistance of clinically relevant microbes against current commercially available antimicrobials underpins the urgent need for alternative and novel treatment strategies. Cationic lipidated oligomers (CLOs) are innovative alternatives to antimicrobial peptides, and have reported antimicrobial potential. An understanding of their antimicrobial mechanism of action is required to rationally design future treatment strategies for CLOs, either in monotherapy or synergistic combinations. In the present study, metabolomics was used to investigate the potential metabolic pathways involved in the mechanisms of antibacterial activity of one CLO, C12-o-(BG-D)-10, which we have previously shown to be effective against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) ATCC 43300. The metabolomes of MRSA ATCC 43300 at 1, 3 and 6 h following treatment with C12-o-(BG-D)-10 (48 µg/mL i.e., 3x MIC) were compared to those of the untreated controls. Our findings reveal that the studied CLO, C12-o-(BG-D)-10, disorganized the bacterial membrane as the first step towards its antimicrobial effect, as evidenced by marked perturbations in the bacterial membrane lipids and peptidoglycan biosynthesis observed at early time points i.e., 1, and 3 h. Central carbon metabolism, and biosynthesis of DNA, RNA, and arginine were also vigorously perturbed, mainly at early time points. Moreover, bacterial cells were under osmotic and oxidative stress across all time points, evident by perturbations of trehalose biosynthesis and pentose phosphate shunt. Overall, this metabolomics study has, for the first time, revealed that the antimicrobial action of C12-o-(BG-D)-10 may potentially stem from the dysregulation of multiple metabolic pathways.","INSTITUTE":"Monash University","DEPARTMENT":"Drug Delivery, Disposition and Dynamics","LABORATORY":"Cornelia Landersdorfer","LAST_NAME":"Hussein","FIRST_NAME":"Maytham","ADDRESS":"Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Microbiology, Monash University, Clayton, Victoria 3800, Australia","EMAIL":"maytham.hussein.old@monash.edu","PHONE":"+61448671141","SUBMIT_DATE":"2024-01-21"},

"SUBJECT":{"SUBJECT_TYPE":"Bacteria","SUBJECT_SPECIES":"Staphylococcus aureus","TAXONOMY_ID":"1280","GENOTYPE_STRAIN":"ATCC 43300","AGE_OR_AGE_RANGE":"NA","WEIGHT_OR_WEIGHT_RANGE":"NA","HEIGHT_OR_HEIGHT_RANGE":"NA","GENDER":"Not applicable"},
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"COLLECTION":{"COLLECTION_SUMMARY":"An untargeted metabolomics study was carried out to explore the mechanism(s) of action of C12-o-(BG-D)-10 against MRSA ATCC 43300 using a concentration of 48 µg/mL (i.e. 3×MIC). Samples were taken and analyzed at the 1-, 3-, and 6-h time points in 4 biological replicates. An overnight culture was prepared by inoculating a single colony into 100 mL CAMHB in 250 mL conical flasks (Pyrex) and incubating the suspension in a shaker at 37°C and 180 rpm for ~16 h. After incubation overnight, log-phase cells were prepared in fresh MHB and then incubated for 2 h at 37°C at 180 rpm to log phase with a starting bacterial inoculum of 108 CFU/mL. Then, C12-o-(BG-D)-10 was added to obtain the desired concentration of 48 µg/mL (3 x MIC), in parallel to a CLO-free control for each replicate. The flasks were then incubated at 37°C with shaking at 180 rpm. At each time point (0, 1, 3, and 6 h), 15-mL samples were transferred to 50-mL Falcon tubes for quenching, and the optical density reading at 600 nm (OD600) was then measured and normalized to the pre-treatment level of approximately ~0.5 with fresh CAMHB. Samples were then centrifuged at 3,220 g and 4°C for 10 min, and the supernatants were removed. The pellets were stored at -80°C until metabolite extraction. The experiment was performed in 4 biological replicates to reduce the bias from inherent random variation.","SAMPLE_TYPE":"Bacterial cells"},

"TREATMENT":{"TREATMENT_SUMMARY":"An untargeted metabolomics study was carried out to explore the mechanism(s) of action of C12-o-(BG-D)-10 against MRSA ATCC 43300 using a concentration of 48 µg/mL (i.e. 3×MIC). Samples were taken and analyzed at the 1-, 3-, and 6-h time points in 4 biological replicates. An overnight culture was prepared by inoculating a single colony into 100 mL CAMHB in 250 mL conical flasks (Pyrex) and incubating the suspension in a shaker at 37°C and 180 rpm for ~16 h. After incubation overnight, log-phase cells were prepared in fresh MHB and then incubated for 2 h at 37°C at 180 rpm to log phase with a starting bacterial inoculum of 108 CFU/mL. Then, C12-o-(BG-D)-10 was added to obtain the desired concentration of 48 µg/mL (3 x MIC), in parallel to a CLO-free control for each replicate. The flasks were then incubated at 37°C with shaking at 180 rpm. At each time point (0, 1, 3, and 6 h), 15-mL samples were transferred to 50-mL Falcon tubes for quenching, and the optical density reading at 600 nm (OD600) was then measured and normalized to the pre-treatment level of approximately ~0.5 with fresh CAMHB. Samples were then centrifuged at 3,220 g and 4°C for 10 min, and the supernatants were removed. The pellets were stored at -80°C until metabolite extraction. The experiment was performed in 4 biological replicates to reduce the bias from inherent random variation.","TREATMENT_DOSE":"48 ug/ml","CELL_MEDIA":"CAMHB"},

"SAMPLEPREP":{"SAMPLEPREP_SUMMARY":"The bacterial pellets were washed twice in 1 mL of 0.9% saline and then centrifuged at 3,220 g and 4°C for 5 min to remove residual extracellular metabolites and medium components. The washed pellets were resuspended in a cold extraction solvent (chloroform-methanol-water at 1:3:1, vol/vol) containing 1 µM each of the internal standards 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS), N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid (CAPS), piperazine-N, N-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), and Tris. The samples were then frozen in liquid nitrogen, thawed on ice, and vortexed to release the intracellular metabolites (3 times). Next, the samples were transferred to 1.5-mL Eppendorf tubes and centrifuged at 14,000 g at 4°C for 10 min to remove any particulate matter. Finally, 200 µL of the supernatant was transferred into injection vials for liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) analysis. An equal volume of each sample was combined and used as a quality control (QC) sample"},

"CHROMATOGRAPHY":{"CHROMATOGRAPHY_SUMMARY":"pHILIC using basic buffer pH9","METHODS_FILENAME":"Metabolomics_pHILIC_Parkville_v1.pdf","INSTRUMENT_NAME":"Thermo Dionex Ultimate 3000","COLUMN_NAME":"SeQuant ZIC-HILIC (150 x 4.6mm,3.5um)","COLUMN_PRESSURE":"60 bar at starting conditions. 180 bar at %A","COLUMN_TEMPERATURE":"25 C","FLOW_GRADIENT":"0 min - 80%B, 15 min - 50%B, 18 min - 5%B, 21 min - 5%B, 24 min - 80%B, 32 min - 80%B","FLOW_RATE":"0.3 ml/min","INJECTION_TEMPERATURE":"4 C","INTERNAL_STANDARD":"CAPS, CHAPS, PIPES","SOLVENT_A":"100% water; 20 mM ammonium carbonate","SOLVENT_B":"100% acetonitrile","ANALYTICAL_TIME":"32 min","CAPILLARY_VOLTAGE":"3.5 kV","OVEN_TEMPERATURE":"25 C","WASHING_BUFFER":"syringe wash 50% IPA","WEAK_WASH_SOLVENT_NAME":"50% IPA","STRONG_WASH_VOLUME":"50% IPA","SAMPLE_LOOP_SIZE":"25 uL","SAMPLE_SYRINGE_SIZE":"25 uL","RANDOMIZATION_ORDER":"yes","CHROMATOGRAPHY_TYPE":"HILIC"},

"ANALYSIS":{"LABORATORY_NAME":"Monash Proteomics and Metabolomics Platform","ANALYSIS_TYPE":"MS","ANALYSIS_PROTOCOL_FILE":"PQMS3-MPMF-WIN-0501_LCMS_data_acquisition_for_untargeted_metabolomics_analysis.pdf","ACQUISITION_DATE":"17/08/2020","ACQUISITION_PARAMETERS_FILE":"Metabolomics_pHILIC_Parkville_v1.pdf","SOFTWARE_VERSION":"XCalibur 4.6","OPERATOR_NAME":"Dovile Anderson","DETECTOR_TYPE":"Full scan","DATA_FORMAT":".RAW"},

"MS":{"INSTRUMENT_NAME":"Thermo Q Exactive Orbitrap","INSTRUMENT_TYPE":"Orbitrap","MS_TYPE":"ESI","MS_COMMENTS":"acquired in full scan using polarity switching in positive and negative ion detection modes","ION_MODE":"POSITIVE","CAPILLARY_TEMPERATURE":"300 C","CAPILLARY_VOLTAGE":"4 kV","COLLISION_ENERGY":"NA","COLLISION_GAS":"NA","DRY_GAS_FLOW":"50","DRY_GAS_TEMP":"120","ION_SOURCE_TEMPERATURE":"120 C","IONIZATION":"ESI","MASS_ACCURACY":"3 ppm","PRECURSOR_TYPE":"[M+H]+","SOURCE_TEMPERATURE":"300"},

"MS_METABOLITE_DATA":{
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