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"METABOLOMICS WORKBENCH":{"STUDY_ID":"ST001888","ANALYSIS_ID":"AN003057","VERSION":"1","CREATED_ON":"August 2, 2021, 10:21 am"},

"PROJECT":{"PROJECT_TITLE":"A Metabolome Atlas of the Aging Mouse Brain (Study part II)","PROJECT_SUMMARY":"The mammalian brain relies on neurochemistry to fulfill its functions. Yet, the complexity of the brain metabolome and its changes during diseases or aging remains poorly understood. To start bridging this gap, we generated a metabolome atlas of the aging wildtype male and female mouse brain from 10 anatomical regions spanning from adolescence to old age. We combined data from three chromatography-based mass spectrometry assays and structurally annotated 1,547 metabolites to reveal the underlying architecture of aging-induced changes in the brain metabolome. Overall differences between sexes were minimal. We found 99% of all metabolites to significantly differ between brain regions in at least one age group. We also discovered that 97% of the metabolome showed significant changes with respect to age groups. For example, we identified a shift in sphingolipid patterns during aging that is related to myelin remodeling in the transition from adolescent to aging brains. This shift was accompanied by large changes in overall signature in a range of other metabolic pathways. We found clear metabolic similarities in brain regions that were functionally related such as brain stem, cerebrum and cerebellum. In cerebrum, metabolic correlation patterns got markedly weaker in the transition from adolescent to adulthood, whereas the overall correlation patterns between all regions reflected a decreased brain segregation at old age. We were also able to map metabolic changes to gene and protein brain atlases to link molecular changes to metabolic brain phenotypes. Metabolic profiles can be investigated via https://mouse.atlas.metabolomics.us/. This new resource enables brain researchers to link new metabolomic studies to a foundation data set.","INSTITUTE":"University of California, Davis","DEPARTMENT":"Genome Center","LABORATORY":"West Coast Metabolomics Center","LAST_NAME":"Ding","FIRST_NAME":"Jun","ADDRESS":"451 East Health Science Drive, Davis, CA, 95616, USA","EMAIL":"junding@ucdavis.edu","PHONE":"773-326-5420","FUNDING_SOURCE":"NIH U2C ES030158, U19 AG023122, and NIH UM1 OD023221"},

"STUDY":{"STUDY_TITLE":"A Metabolome Atlas of the Aging Mouse Brain (Study part II)","STUDY_SUMMARY":"The mammalian brain relies on neurochemistry to fulfill its functions. Yet, the complexity of the brain metabolome and its changes during diseases or aging remains poorly understood. To start bridging this gap, we generated a metabolome atlas of the aging wildtype male and female mouse brain from 10 anatomical regions spanning from adolescence to old age. We combined data from three chromatography-based mass spectrometry assays and structurally annotated 1,547 metabolites to reveal the underlying architecture of aging-induced changes in the brain metabolome. Overall differences between sexes were minimal. We found 99% of all metabolites to significantly differ between brain regions in at least one age group. We also discovered that 97% of the metabolome showed significant changes with respect to age groups. For example, we identified a shift in sphingolipid patterns during aging that is related to myelin remodeling in the transition from adolescent to aging brains. This shift was accompanied by large changes in overall signature in a range of other metabolic pathways. We found clear metabolic similarities in brain regions that were functionally related such as brain stem, cerebrum and cerebellum. In cerebrum, metabolic correlation patterns got markedly weaker in the transition from adolescent to adulthood, whereas the overall correlation patterns between all regions reflected a decreased brain segregation at old age. We were also able to map metabolic changes to gene and protein brain atlases to link molecular changes to metabolic brain phenotypes. Metabolic profiles can be investigated via https://mouse.atlas.metabolomics.us/. This new resource enables brain researchers to link new metabolomic studies to a foundation data set.","INSTITUTE":"University of California, Davis","DEPARTMENT":"Genome Center","LABORATORY":"West Coast Metabolomics Center","LAST_NAME":"Ding","FIRST_NAME":"Jun","ADDRESS":"451 East Health Science Drive, Davis, CA, 95616, USA","EMAIL":"junding@ucdavis.edu","PHONE":"773-326-5420"},

"SUBJECT":{"SUBJECT_TYPE":"Mammal","SUBJECT_SPECIES":"Mus musculus","TAXONOMY_ID":"10090","GENOTYPE_STRAIN":"C57BL/6NCrl","AGE_OR_AGE_RANGE":"92 weeks old","GENDER":"Male and female"},
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"Additional sample data":{"Age":"-","RAW_FILE_NAME":"OldMAPool019_MX591555_posHILIC_postDing176","Ding133_MX591555_negHILIC_900483-009-001":"OldMAPool019_MX591555_negHILIC_postDing176","Ding120_MX591366_posCSH_900483-009-001":"OldMAPool019_MX591366_posCSH_postDing176","Ding120_MX591366_negCSH_900483-009-001":"OldMAPool019_MX591366_negCSH_postDing176","210427bmgsa32_1":"210429bmgsa42_2"}
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"COLLECTION":{"COLLECTION_SUMMARY":"Brain tissue samples were collected from 92 weeks old male and female wild type mice on a C57BL/6N background and performed under approved institutional IACUC protocols. Briefly, mice were anesthetized with 4% Isoflurane in 100% oxygen at a flow rate of 3 L/h to a surgical plane. Blood was then collected by retro-orbital bleed into an EDTA tube and centrifuged at 3000 rpm for 15 min to separate and remove plasma. While under anesthsia mice were perfused for approximately 10 minutes with phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 at room temperature. Following perfusion, the brain was removed and placed in a petri dish containing PBS at 4oC for dissection of individual brain regions. A dissection microscope, fine tip (#5) forceps, and razor blade was used to isolate and separate brain regions (olfactory bulb, hippocampus, hypothalamus, thalamus, midbrain, cerebellum, pons, medulla, cerebral cortex, and basal ganglia collected as caudate putamen and basal forebrain) in induvial mice while being careful to avoid contamination from neighboring regions. Briefly, after separating the olfactory bulbs, the left and right cerebral cortices were then removed while taking care not to disrupt the regions underneath. This enabled access to and removal of the left and right hippocampus. After cutting along the thalamus, the left and right caudate putamen was separated and removed from the basal forebrain. Subsequently, the cerebellum and midbrain were isolated and removed, followed by separation and removal of the thalamus and the hypothalamus from the pons and medulla. The pons was then separated from the medulla. Any spinal cord remaining on the medulla was removed. Each region was immediately placed in a cryo vial and flash frozen in liquid nitrogen for analysis.","SAMPLE_TYPE":"Brain"},

"TREATMENT":{"TREATMENT_SUMMARY":"Five milligrams of tissue from each brain region were homogenized in 225 µL of -20˚C cold, internal standard-containing methanol using a GenoGrinder 2010 (SPEX SamplePrep) for 2 min at 1,350 rpm. The homogenate was vortexed for 10 s. 750 µL of -20˚C cold, internal standard-containing methyl tertiary-butyl ether (MTBE) was added, and the mixture was vortexed for 10 s and shaken at 4˚C for 5 min with an Orbital Mixing Chilling/Heating Plate (Torrey Pines Scientific Instruments). MTBE contained cholesteryl ester 22:1 as internal standard. Next, 188 µL room temperature water was added and vortexed for 20s to induce phase separation. After centrifugation for 2min at 14,000 g, two 350 µL aliquots of the upper non-polar phase and two 125 µL aliquots of the bottom polar phase were collected and dried down. Remaining fractions were combined to form QC pools and were injected after every set of 10 biological samples. The non-polar phase employed for lipidomics was resuspended in a mixture of methanol/toluene (60 µL, 9:1, v/v) containing an internal standard [12-[(cyclohexylamino) carbonyl]amino]-dodecanoic acid (CUDA)] before injection. Resuspension of dried polar phases for HILIC analysis was performed in a mixture of internal standard-containing acetonitrile/water (90 µL, 4:1, v/v). The second dried polar phase was reserved for GC analysis and a following derivatization process was carried out before injection. First, carbonyl groups were protected by methoximation with methoxyamine hydrochloride in pyridine (40 mg/mL, 10 µL) was added to the dried samples. Then, the mixture was incubated at 30˚C for 90 min followed by trimethylsilylation with N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (MSTFA, 90 μL) containing C8–C30 fatty acid methyl esters (FAMEs) as internal standards by shaking at 37˚C for 30min."},

"SAMPLEPREP":{"SAMPLEPREP_SUMMARY":"Five milligrams of tissue from each brain region were homogenized in 225 µL of -20˚C cold, internal standard-containing methanol using a GenoGrinder 2010 (SPEX SamplePrep) for 2min at 1,350 rpm. The homogenate was vortexed for 10s. 750 µL of -20˚C cold, internal standard-containing methyl tertiary-butyl ether (MTBE) was added, and the mixture was vortexed for 10 s and shaken at 4˚C for 5min with an Orbital Mixing Chilling/Heating Plate (Torrey Pines Scientific Instruments). MTBE contained cholesteryl ester 22:1 as internal standard. Next, 188 µL room temperature water was added and vortexed for 20s to induce phase separation. After centrifugation for 2min at 14,000 g, two 350 µL aliquots of the upper non-polar phase and two 125 µL aliquots of the bottom polar phase were collected and dried down. Remaining fractions were combined to form QC pools and were injected after every set of 10 biological samples. The non-polar phase employed for lipidomics was resuspended in a mixture of methanol/toluene (60 µL, 9:1, v/v) containing an internal standard [12-[(cyclohexylamino) carbonyl]amino]-dodecanoic acid (CUDA)] before injection. Resuspension of dried polar phases for HILIC analysis was performed in a mixture of internal standard-containing acetonitrile/water (90 µL, 4:1, v/v). The second dried polar phase was reserved for GC analysis and a following derivatization process was carried out before injection. First, carbonyl groups were protected by methoximation with methoxyamine hydrochloride in pyridine (40 mg/mL, 10 µL) was added to the dried samples. Then, the mixture was incubated at 30˚C for 90 min followed by trimethylsilylation with N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (MSTFA, 90 μL) containing C8–C30 fatty acid methyl esters (FAMEs) as internal standards by shaking at 37˚C for 30min."},

"CHROMATOGRAPHY":{"CHROMATOGRAPHY_SUMMARY":"HILIC positive","CHROMATOGRAPHY_TYPE":"HILIC","INSTRUMENT_NAME":"Thermo Vanquish","COLUMN_NAME":"Waters XBridge Amide (100 x 4.6mm, 3.5um)"},

"ANALYSIS":{"ANALYSIS_TYPE":"MS"},

"MS":{"INSTRUMENT_NAME":"Thermo Q Exactive HF hybrid Orbitrap","INSTRUMENT_TYPE":"Orbitrap","MS_TYPE":"ESI","ION_MODE":"POSITIVE","MS_COMMENTS":"The ion source conditions were set as follows: spray voltage, 3.6 kV; sheath gas flow rate, 60 arbitrary units; aux gas flow rate, 25 arbitrary units; sweep gas flow rate, 2 arbitrary units; capillary temp, 300 °C; S-lens RF level, 50; Aux gas heater temp, 370 °C. The following acquisition parameters were used for MS1 analysis: resolution, 60000, AGC target, 1e6; Maximum IT, 100 ms; scan range 60-900 m/z; spectrum data type, centroid. Data dependent MS/MS parameters: resolution, 15000; AGC target, 1e5; maximum IT, 50 ms; loop count, 4; TopN, 4; isolation window, 1.0 m/z; fixed first mass, 70.0 m/z; (N)CE/ stepped nce, 20, 30, 40; spectrum data type, centroid; minimum AGC target, 8e3; intensity threshold, 1.6e5; exclude isotopes, on; dynamic exclusion, 3.0 s. To increase the total number of MS/MS spectra, five runs with iterative MS/MS exclusions were performed using the R package “IE-Omics”18 for both positive and negative electrospray conditions. All the LC-MS raw data files were converted into ABF format using ABF converter (https://www.reifycs.com/AbfConverter/). MS-DIAL ver.4.00 software was used for deconvolution, peak picking, alignment, and compound identification19. The detailed parameter setting was as follows: MS1 tolerance, 0.005 Da; MS2 tolerance, 0.01 Da; minimum peak height, 20000 amplitude; mass slice width, 0.1 Da; smoothing method, linear weighted moving average; smoothing level, 5 scans; minimum peak width, 10 scans. [M+H]+, [M+NH4]+, [M+Na]+, [2M+H]+,[2M+NH4]+, [2M+Na]+ were included in adduct ion setting for positive mode lipidomics and HILIC analysis, [M-H]-, [M+Cl]-, [M+Hac-H]- for negative mode lipidomics, and [M-H]-, [M+Cl]-, [M+FA-H]-, [2M-H]- for negative mode HILIC analysis. Compounds were annotated by matching retention times, accurate precursor masses and MS/MS spectra against libraries in MassBank of North America and NIST17. Retention time libraries were produced from authentic standards and extrapolated for lipids as published before. The primary result data matrix was processed with MS-FLO software to identify ion adducts, duplicate peaks, and isotopic features. Systematic error removal by random forest (SERRF software) was employed to correct for batch effects or instrument signal drifts. Statistical analysis was performed by normalization to the median intensity of all identified compounds, log transformation and Pareto scaling. PCA was used for multivariate statistics and visualization, specifically for outlier detection. Two outliers, including one medulla sample from a female early adult and one basal ganglia sample from a female late adult, were removed. Results from Kruskal-Wallis tests were followed by Dunn’s multiple comparison confinement. Results from Mann–Whitney U tests were corrected by the Benjamini–Hochberg procedure to control the false discovery rate. Spearman rank correlation analyses and fold change calculations were conducted using R."},

"MS_METABOLITE_DATA":{
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"Metabolites":[{"Metabolite":"(-)-N-Acetylneuraminic acid","Pubchem CID":"14017587","Average Mz":"274","Average Rt(min)":"8"},{"Metabolite":"(2R)-3-Hydroxyisovaleroylcarnitine","Pubchem CID":"131668011","Average Mz":"262","Average Rt(min)":"7"},{"Metabolite":"(3-Carboxypropyl)trimethylammonium cation","Pubchem CID":"134","Average Mz":"146","Average Rt(min)":"8"},{"Metabolite":".gamma.-Aminobutyric acid","Pubchem CID":"119","Average Mz":"86","Average Rt(min)":"8"},{"Metabolite":"1,5-Hexadien-3-ol","Pubchem CID":"79122","Average Mz":"81","Average Rt(min)":"1"},{"Metabolite":"1,5-Pentanediamine","Pubchem CID":"273","Average Mz":"86","Average Rt(min)":"7"},{"Metabolite":"10-Hydroxy-2-decenoic acid","Pubchem CID":"5312738","Average Mz":"133","Average Rt(min)":"1"},{"Metabolite":"13-Keto-9Z,11E-octadecadienoic acid","Pubchem CID":"6446027","Average Mz":"295","Average Rt(min)":"1"},{"Metabolite":"1-Cycloheptyl-4-piperidinamine","Pubchem CID":"4778241","Average Mz":"180.1748_163.1482","Average 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