#METABOLOMICS WORKBENCH sbhattacharya_20181003_115440 DATATRACK_ID:1524 STUDY_ID:ST001073 ANALYSIS_ID:AN001755 VERSION 1 CREATED_ON 02-08-2024 #PROJECT PR:PROJECT_TITLE Lipid profiling of Wnt3a-induced optic nerve regeneration PR:PROJECT_TYPE untargeted lipid profiling PR:PROJECT_SUMMARY We analyzed lipid profiles of mouse retina and optic nerve at 2 time points - 7 PR:PROJECT_SUMMARY and 15 days post-crush, and 3 conditions - intact control, optic nerve crush + PR:PROJECT_SUMMARY vehicle (saline) intravitreal injection, optic nerve crush + 20 ng of Wnt3a PR:PROJECT_SUMMARY injection. PR:INSTITUTE University of Miami PR:DEPARTMENT Ophthalmology, Bascom Palmer Eye Institute PR:LABORATORY Sanjoy K. Bhattacharya lab PR:LAST_NAME Bhattacharya PR:FIRST_NAME Sanjoy PR:ADDRESS Bascom Palmer Eye Institute (McKnight Bldg.), 1638 NW 10th Avenue, Suite 707A, PR:ADDRESS University of Miami, Miami, FL, 33136 PR:EMAIL sbhattacharya@med.miami.edu PR:PHONE 305-482-4103 PR:DOI http://dx.doi.org/10.21228/M8VT2P PR:CONTRIBUTORS Abigail S. Hackam, Tal Carmy, Anna Trzeciecka #STUDY ST:STUDY_TITLE Lipid profiling of Wnt3a-induced optic nerve regeneration ST:STUDY_TYPE untargeted lipid profiling ST:STUDY_SUMMARY We analyzed lipid profiles of mouse retina and optic nerve for 2 time points - 7 ST:STUDY_SUMMARY and 15 days post-crush, and 3 conditions - intact control, optic nerve crush + ST:STUDY_SUMMARY vehicle (saline) intravitreal injection, optic nerve crush + 20 ng of Wnt3a ST:STUDY_SUMMARY injection. ST:INSTITUTE University of Miami ST:DEPARTMENT Ophthalmology, Bascom Palmer Eye Institute ST:LABORATORY Sanjoy K. Bhattacharya lab ST:LAST_NAME Bhattacharya ST:FIRST_NAME Sanjoy ST:ADDRESS Bascom Palmer Eye Institute (McKnight Bldg.), 1638 NW 10th Avenue, Suite 707A, ST:ADDRESS University of Miami, Miami, FL, 33136 ST:EMAIL sbhattacharya@med.miami.edu ST:PHONE 305-482-4103 ST:SUBMIT_DATE 2018-10-03 #SUBJECT SU:SUBJECT_TYPE Mammal SU:SUBJECT_SPECIES Mus musculus SU:TAXONOMY_ID 10090 SU:GENOTYPE_STRAIN Tcf/LacZ mice SU:AGE_OR_AGE_RANGE 6-8 weeks SU:GENDER Male and female SU:ANIMAL_INCLUSION_CRITERIA The Tcf/LacZ strain was previously backcrossed onto the C3H background C3H SU:ANIMAL_INCLUSION_CRITERIA background, and confirmed by PCR to lack the rd1 mutation #SUBJECT_SAMPLE_FACTORS: SUBJECT(optional)[tab]SAMPLE[tab]FACTORS(NAME:VALUE pairs separated by |)[tab]Additional sample data SUBJECT_SAMPLE_FACTORS QC pooled HA2_1-24 QC1 Crush:N/A | Saline treatment:N/A | Wnt3a treatment:N/A | Day post-crush:15 Eye=N/A; Tissue=N/A; ESI mode=positive/negative; NCE=15/30/45/60/75/90 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS QC pooled HA2_1-24 QC2 Crush:N/A | Saline treatment:N/A | Wnt3a treatment:N/A | Day post-crush:15 Eye=N/A; 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Tissue=ON; ESI mode=positive/negative; NCE=15/30/45/60/75/90 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 20F3J-5 HA_17 Crush:Yes | Saline treatment:Yes | Wnt3a treatment:No | Day post-crush:7 Eye=OS; Tissue=retina; ESI mode=positive/negative; NCE=15/30/45/60/75/90 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 20F3J-5 HA_18 Crush:Yes | Saline treatment:Yes | Wnt3a treatment:No | Day post-crush:7 Eye=OS; Tissue=ON; ESI mode=positive/negative; NCE=15/30/45/60/75/90 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 20F3I-2 HA_21 Crush:Yes | Saline treatment:Yes | Wnt3a treatment:No | Day post-crush:7 Eye=OS; Tissue=retina; ESI mode=positive/negative; NCE=15/30/45/60/75/90 SUBJECT_SAMPLE_FACTORS 20F3I-2 HA_22 Crush:Yes | Saline treatment:Yes | Wnt3a treatment:No | Day post-crush:7 Eye=OS; Tissue=ON; ESI mode=positive/negative; NCE=15/30/45/60/75/90 #COLLECTION CO:COLLECTION_SUMMARY All procedures involving mice were performed in accordance with the ARVO CO:COLLECTION_SUMMARY Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research and were CO:COLLECTION_SUMMARY approved by the Animal Care and Use Committee at the University of Miami. The CO:COLLECTION_SUMMARY optic nerve crush and associated treatments were done on Tcf/LacZ mice. As CO:COLLECTION_SUMMARY described previously1, the Tcf/LacZ mouse is a transgenic canonical Wnt reporter CO:COLLECTION_SUMMARY line that allows localization of active Wnt/β-catenin signaling. In these mice, CO:COLLECTION_SUMMARY binding of endogenous nuclear β-catenin to T-cell factor/lymphoid CO:COLLECTION_SUMMARY enhancer-binding factor (TCF/Lef) elements in a Wnt-responsive enhancer/promoter CO:COLLECTION_SUMMARY region upstream of the LacZ transgene leads to induction of CO:COLLECTION_SUMMARY LacZ/β-galactosidase (β-gal) expression wherever Wnt signaling is active. The CO:COLLECTION_SUMMARY Tcf/LacZ strain was previously backcrossed onto the C3H background C3H CO:COLLECTION_SUMMARY background, and confirmed by PCR to lack the rd1 mutation. Optic nerve crush CO:COLLECTION_SUMMARY (ONC) injury was performed as described previously. A total of twelve Tcf/LacZ CO:COLLECTION_SUMMARY mice were used for this study. Six mice were used for a 7 day period and six CO:COLLECTION_SUMMARY mice were used for a 14 day period. The mice were used at the age of 6-8 weeks CO:COLLECTION_SUMMARY and were anesthetized using a ketamine/xylazine cocktail which was injected CO:COLLECTION_SUMMARY intraperitoneally. Once the mice were under the anesthesia, the eyes were CO:COLLECTION_SUMMARY locally anesthetized with 0.5% proparacaine hydrochloride. The mice were placed CO:COLLECTION_SUMMARY on a heating pad to begin the optic nerve crush procedure. Mice of either sex CO:COLLECTION_SUMMARY were randomly selected to receive intravitreal injection of recombinant CO:COLLECTION_SUMMARY 20ngWnt3a ligand group or saline control group (saline was injected with CO:COLLECTION_SUMMARY equivalent volume as recombinant 20ngWnt3a ligand). A small diabetic needle was CO:COLLECTION_SUMMARY used to make an incision in the superior posterior area of the CO:COLLECTION_SUMMARY conjunctiva-sclera border of the left eye. After which, either recombinant CO:COLLECTION_SUMMARY 20ngWnt3a ligand or saline was injected intravitreally using a 1.5 cm 33-gauge CO:COLLECTION_SUMMARY Hamilton needle (Hamilton Company, Reno, NV). The injection needle was angled to CO:COLLECTION_SUMMARY avoid hitting the lens. The surface membrane of the left eye was cut around the CO:COLLECTION_SUMMARY conjunctiva-sclera border. Dumont #5 forceps were inserted between the membrane CO:COLLECTION_SUMMARY and the globe to move the surrounding tissues while searching for the optic CO:COLLECTION_SUMMARY nerve. Once the optic nerve was located, the forceps’ teeth surrounded the CO:COLLECTION_SUMMARY nerve 1 mm from the globe and crushed the nerve for 5 seconds. The crush is CO:COLLECTION_SUMMARY successful if there is very minimal or no damage to the surrounding blood CO:COLLECTION_SUMMARY supply. Affected left eyes were treated with topical erythromycin ointment and CO:COLLECTION_SUMMARY 1mg/ml of Buprenorphine-SR lab was injected subcutaneously. Any mouse with CO:COLLECTION_SUMMARY excessive bleeding around the eye was excluded from the study. Mouse’s overall CO:COLLECTION_SUMMARY health and left eye’s health were monitored daily from day 1 post crush until CO:COLLECTION_SUMMARY day 7 post crush. Mice portraying lethargy 24 hours after surgery or eye CO:COLLECTION_SUMMARY infection to the affected eye days after surgery were excluded from the study. CO:COLLECTION_SUMMARY OCT scans were obtained from left and right eyes of the mouse while anesthetized CO:COLLECTION_SUMMARY on the day of euthanasia. Nerves and retinas were removed immediately after OCT CO:COLLECTION_SUMMARY scan for mass spectrometry analysis. CO:SAMPLE_TYPE Eye tissue CO:COLLECTION_FREQUENCY 7 and 15 days post-crush CO:VOLUMEORAMOUNT_COLLECTED entire retina or optic nerve CO:STORAGE_CONDITIONS -80℃ CO:STORAGE_VIALS low-binding 1.5 mL Eppendorf tubes #TREATMENT TR:TREATMENT_SUMMARY Mice of either sex were randomly selected to receive intravitreal injection of TR:TREATMENT_SUMMARY recombinant 20ng Wnt3a ligand group or saline control group (saline was injected TR:TREATMENT_SUMMARY with equivalent volume as recombinant 20ng Wnt3a ligand). A small diabetic TR:TREATMENT_SUMMARY needle was used to make an incision in the superior posterior area of the TR:TREATMENT_SUMMARY conjunctiva-sclera border of the left eye. After which, either recombinant TR:TREATMENT_SUMMARY 20ngWnt3a ligand or saline was injected intravitreally using a 1.5 cm 33-gauge TR:TREATMENT_SUMMARY Hamilton needle (Hamilton Company, Reno, NV). The injection needle was angled to TR:TREATMENT_SUMMARY avoid hitting the lens. The surface membrane of the left eye was cut around the TR:TREATMENT_SUMMARY conjunctiva-sclera border. Dumont #5 forceps were inserted between the membrane TR:TREATMENT_SUMMARY and the globe to move the surrounding tissues while searching for the optic TR:TREATMENT_SUMMARY nerve. Once the optic nerve was located, the forceps’ teeth surrounded the TR:TREATMENT_SUMMARY nerve 1 mm from the globe and crushed the nerve for 5 seconds. The crush is TR:TREATMENT_SUMMARY successful if there is very minimal or no damage to the surrounding blood TR:TREATMENT_SUMMARY supply. Affected left eyes were treated with topical erythromycin ointment and TR:TREATMENT_SUMMARY 1mg/ml of Buprenorphine-SR lab was injected subcutaneously. Animal Anesthesia: TR:TREATMENT_SUMMARY ketamine/xylazine cocktail intraperitoneally, eyes were locally anesthetized TR:TREATMENT_SUMMARY with 0.5% proparacaine hydrochloride.Any mouse with excessive bleeding around TR:TREATMENT_SUMMARY the eye was excluded from the study. Mouse’s overall health and left eye’s TR:TREATMENT_SUMMARY health were monitored daily from day 1 post crush until day 7 post crush. Animal TR:TREATMENT_SUMMARY Endpoint Clinical Signs: Mice portraying lethargy 24 hours after surgery or eye TR:TREATMENT_SUMMARY infection to the affected eye days after surgery were excluded from the study. TR:TREATMENT optic nerve crush, intravitreal injection TR:TREATMENT_COMPOUND Wnt3a or saline TR:TREATMENT_ROUTE intravitreal injection TR:TREATMENT_DOSEVOLUME 20 ng of Wnt3a or equal volume of saline TR:TREATMENT_DOSEDURATION single injection TR:ANIMAL_ANESTHESIA See summary TR:ANIMAL_ENDP_EUTHANASIA CO2 + decapitation TR:ANIMAL_ENDP_TISSUE_COLL_LIST retina, optic nerve TR:ANIMAL_ENDP_CLINICAL_SIGNS See summary #SAMPLEPREP SP:SAMPLEPREP_SUMMARY 4 mL of methanol (LC-MS grade) and 2 mL of chloroform (LC-MS grade) were added SP:SAMPLEPREP_SUMMARY to each sample. After 2 min vigorous vortexing and 2 min sonication in SP:SAMPLEPREP_SUMMARY ultrasonic bath, the samples were incubated at 48˚C overnight (in borosilicate SP:SAMPLEPREP_SUMMARY glass vials, PTFE-lined caps). The following day, 2 mL of water (LC-MS grade) SP:SAMPLEPREP_SUMMARY and 1 mL of chloroform were added, samples vigorously vortexed for 2 min and SP:SAMPLEPREP_SUMMARY centrifuged at 3000 RCF, 4˚C for 15 min to obtain phase separation. Lower SP:SAMPLEPREP_SUMMARY phases were collected and dried in centrifugal vacuum concentrator. Samples were SP:SAMPLEPREP_SUMMARY stored at -20˚C until reconstituted in 150 µL of chloroform:methanol (1:1) SP:SAMPLEPREP_SUMMARY prior to mass spectrometric analysis. Lipid profiling was performed in 2 SP:SAMPLEPREP_SUMMARY batches: 7 day and 15 day period. For the 15 day period, quality control (QC) SP:SAMPLEPREP_SUMMARY pooled sample was prepared and run 6 times throughout the batch. SP:PROCESSING_METHOD lipid extraction SP:PROCESSING_STORAGE_CONDITIONS Described in summary SP:EXTRACTION_METHOD chloroform, methanol, water phase separation SP:EXTRACT_STORAGE -80℃ SP:SAMPLE_RESUSPENSION 150 µL of chloroform:methanol (1:1) SP:SAMPLE_SPIKING no internal standards added #CHROMATOGRAPHY CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY Reversed phase chromatographic separation utilized Accela Autosampler (Thermo), CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY Accela 600 pump (Thermo) and Acclaim C30 column: 3 µm, 2.1x150 mm (Thermo). The CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY column temperature was maintained at 30˚C and tray temperature at 20˚C. CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY Solvent A was composed of 10 mM ammonium acetate (LC-MS grade) in 60:40 CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY methanol:water (LC-MS grade) with 0.2% formic acid (FA; LC-MS grade). Solvent B CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY was composed of 10 mM ammonium acetate with 60:40 methanol:chloroform with 0.2% CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY FA. The flow rate was 260 µL/min and injection volume was 10 µL. The gradient CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY was 35-100% solvent B over 13.0 min, 100% solvent B over 13.0-13.8 min, CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY 100-35% solvent B over 13.8-14.5 min, 35% solvent B over 14.5-18.0 min, 0% CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY solvent B over 18.0-20.0 min. CH:INSTRUMENT_NAME Thermo Accela 600 CH:COLUMN_NAME Thermo Acclaim C30 (150 x 2.1mm,3um) CH:COLUMN_TEMPERATURE 30˚C CH:FLOW_GRADIENT The gradient was 35-100% solvent B over 13.0 min, 100% solvent B over CH:FLOW_GRADIENT 13.0-13.8 min, 100-35% solvent B over 13.8-14.5 min, 35% solvent B over CH:FLOW_GRADIENT 14.5-18.0 min, 0% solvent B over 18.0-20.0 min. CH:FLOW_RATE 260 µL/min CH:SAMPLE_INJECTION 10 µL CH:SOLVENT_A 60% methanol/40% water; 0.2% formic acid; 10 mM ammonium acetate CH:SOLVENT_B 60% methanol/40% chloroform; 0.2% formic acid; 10 mM ammonium acetate CH:ANALYTICAL_TIME 20 min CH:WASHING_BUFFER methanol CH:CHROMATOGRAPHY_TYPE Reversed phase #ANALYSIS AN:ANALYSIS_TYPE MS AN:DATA_FORMAT RAW #MS MS:INSTRUMENT_NAME Thermo Q Exactive Orbitrap MS:INSTRUMENT_TYPE Orbitrap MS:MS_TYPE ESI MS:MS_COMMENTS positive and negative mode aligned together MS:ION_MODE UNSPECIFIED MS:CAPILLARY_TEMPERATURE 310˚C (negative mode) or 350˚C (positive mode) MS:COLLISION_ENERGY 15, 30, 45, 60, 75, 90 (in positive and negative mode separately; total 12 runs MS:COLLISION_ENERGY per sample) MS:ION_SPRAY_VOLTAGE 4.4 kV #MS_METABOLITE_DATA MS_METABOLITE_DATA:UNITS relative abundance (main area) MS_METABOLITE_DATA_START Samples QC1 QC2 QC3 QC4 QC5 QC6 HA2_1 HA2_14 HA2_15 HA2_16 HA2_17 HA2_18 HA2_2 HA2_23 HA2_24 HA2_3 HA2_4 HA2_5 HA_11 HA_12 HA_15 HA_16 HA_19 HA_20 HA_23 HA_24 HA_3 HA_4 HA_7 HA_8 HA2_11 HA2_12 HA2_13 HA2_7 HA2_8 HA2_9 HA_1 HA_10 HA_2 HA_5 HA_6 HA_9 HA2_10 HA2_19 HA2_20 HA2_21 HA2_22 HA2_6 HA_13 HA_14 HA_17 HA_18 HA_21 HA_22 Factors Crush:N/A | Saline treatment:N/A | Wnt3a treatment:N/A | Day post-crush:15 Crush:N/A | Saline treatment:N/A | Wnt3a treatment:N/A | Day post-crush:15 Crush:N/A | Saline treatment:N/A | Wnt3a treatment:N/A | Day post-crush:15 Crush:N/A | Saline treatment:N/A | Wnt3a treatment:N/A | Day post-crush:15 Crush:N/A | Saline treatment:N/A | Wnt3a treatment:N/A | Day post-crush:15 Crush:N/A | Saline treatment:N/A | Wnt3a treatment:N/A | Day post-crush:15 Crush:No | Saline treatment:No | Wnt3a treatment:No | Day post-crush:15 Crush:No | Saline treatment:No | Wnt3a treatment:No | Day post-crush:15 Crush:No | Saline treatment:No | Wnt3a treatment:No | Day post-crush:15 Crush:No | Saline treatment:No | Wnt3a treatment:No | Day post-crush:15 Crush:No | Saline treatment:No | Wnt3a treatment:No | Day 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