#METABOLOMICS WORKBENCH bcdefelice_20230824_084726 DATATRACK_ID:4245 STUDY_ID:ST002832 ANALYSIS_ID:AN004625 PROJECT_ID:PR001774 VERSION 1 CREATED_ON 06-05-2025 #PROJECT PR:PROJECT_TITLE Resource competition predicts assembly of in vitro gut bacterial communities PR:PROJECT_SUMMARY Microbiota dynamics arise from a plethora of interspecies interactions, PR:PROJECT_SUMMARY including resource competition, cross-feeding, and pH modulation. The individual PR:PROJECT_SUMMARY contributions of these mechanisms are challenging to untangle, especially in PR:PROJECT_SUMMARY natural or complex laboratory environments where the landscape of resource PR:PROJECT_SUMMARY competition is unclear. Here, we developed a framework to estimate the extent of PR:PROJECT_SUMMARY multi-species niche overlaps by combining metabolomics data of individual PR:PROJECT_SUMMARY species, growth measurements in pairwise spent media, and mathematical models. PR:PROJECT_SUMMARY When applied to an in vitro model system of human gut commensals in complex PR:PROJECT_SUMMARY media, our framework revealed that a simple model of resource competition PR:PROJECT_SUMMARY described most pairwise interactions. By grouping metabolomic features depleted PR:PROJECT_SUMMARY by the same set of species, we constructed a coarse-grained consumer-resource PR:PROJECT_SUMMARY model that predicted assembly compositions to reasonable accuracy. Moreover, PR:PROJECT_SUMMARY deviations from model predictions enabled us to identify and incorporate into PR:PROJECT_SUMMARY the model additional interactions, including pH-mediated effects and PR:PROJECT_SUMMARY cross-feeding, which improved model performance. In sum, our work provides an PR:PROJECT_SUMMARY experimental and theoretical framework to dissect microbial interactions in PR:PROJECT_SUMMARY complex in vitro environments. PR:INSTITUTE Stanford University PR:LAST_NAME DeFelice PR:FIRST_NAME Brian PR:ADDRESS 1291 Welch Rd., Rm. G0821 (SIM1), Stanford CA, California, 94305, USA PR:EMAIL bcdefelice@ucdavis.edu PR:PHONE 5303564485 PR:DOI http://dx.doi.org/10.21228/M8DB1F #STUDY ST:STUDY_TITLE Resource competition predicts assembly of in vitro gut bacterial communities- ST:STUDY_TITLE HILIC ST:STUDY_SUMMARY Microbiota dynamics arise from a plethora of interspecies interactions, ST:STUDY_SUMMARY including resource competition, cross-feeding, and pH modulation. The individual ST:STUDY_SUMMARY contributions of these mechanisms are challenging to untangle, especially in ST:STUDY_SUMMARY natural or complex laboratory environments where the landscape of resource ST:STUDY_SUMMARY competition is unclear. Here, we developed a framework to estimate the extent of ST:STUDY_SUMMARY multi-species niche overlaps by combining metabolomics data of individual ST:STUDY_SUMMARY species, growth measurements in pairwise spent media, and mathematical models. ST:STUDY_SUMMARY When applied to an in vitro model system of human gut commensals in complex ST:STUDY_SUMMARY media, our framework revealed that a simple model of resource competition ST:STUDY_SUMMARY described most pairwise interactions. By grouping metabolomic features depleted ST:STUDY_SUMMARY by the same set of species, we constructed a coarse-grained consumer-resource ST:STUDY_SUMMARY model that predicted assembly compositions to reasonable accuracy. Moreover, ST:STUDY_SUMMARY deviations from model predictions enabled us to identify and incorporate into ST:STUDY_SUMMARY the model additional interactions, including pH-mediated effects and ST:STUDY_SUMMARY cross-feeding, which improved model performance. In sum, our work provides an ST:STUDY_SUMMARY experimental and theoretical framework to dissect microbial interactions in ST:STUDY_SUMMARY complex in vitro environments. ST:INSTITUTE Stanford University ST:LAST_NAME DeFelice ST:FIRST_NAME Brian ST:ADDRESS 1291 Welch Rd. ST:EMAIL bcdefelice@ucdavis.edu ST:PHONE 5303564485 ST:SUBMIT_DATE 2023-08-24 #SUBJECT SU:SUBJECT_TYPE Bacteria SU:SUBJECT_SPECIES Bacteroides thetaiotaomicron SU:TAXONOMY_ID 818 SU:SUBJECT_COMMENTS Fecal derived communities and isolates, supernatant was assayed SU:SPECIES_GROUP Bacteria #SUBJECT_SAMPLE_FACTORS: SUBJECT(optional)[tab]SAMPLE[tab]FACTORS(NAME:VALUE pairs separated by |)[tab]Additional sample data SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - M00179_20220322_Neg_1_MSA0045 Genotype:bacterial community | Treatment:15-member community timepoint 1 RAW_FILE_NAME=M00179_20220322_Neg_1_MSA0045.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - M00179_20220322_Neg_1_MSA0046 Genotype:bacterial community | Treatment:15-member community timepoint 1 RAW_FILE_NAME=M00179_20220322_Neg_1_MSA0046.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - M00179_20220322_Neg_1_MSA0053 Genotype:bacterial community | Treatment:15-member community timepoint 1 RAW_FILE_NAME=M00179_20220322_Neg_1_MSA0053.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - M00179_20220322_Pos_1_MSA0045 Genotype:bacterial community | Treatment:15-member community timepoint 1 RAW_FILE_NAME=M00179_20220322_Pos_1_MSA0045.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 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metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0002 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Clostridium symbiosum RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0002.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0045 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Clostridium symbiosum RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0045.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0047 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Clostridium symbiosum RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0047.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0002 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Clostridium symbiosum RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0002.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0045 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Clostridium symbiosum RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0045.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0047 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Clostridium symbiosum RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0047.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0008 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecalis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0008.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0052 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecalis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0052.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0056 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecalis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0056.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0008 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecalis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0008.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0052 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecalis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0052.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0056 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecalis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0056.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0020 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecium RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0020.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0023 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecium RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0023.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0048 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecium RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0048.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0020 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecium RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0020.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0023 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecium RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0023.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0048 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecium RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0048.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0005 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus hirae RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0005.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0017 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus hirae RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0017.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0046 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus hirae RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0046.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0005 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus hirae RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0005.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0017 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus hirae RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0017.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0046 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus hirae RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0046.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0006 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Escherichia fergusonii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0006.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0043 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Escherichia fergusonii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0043.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0051 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Escherichia fergusonii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0051.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0006 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Escherichia fergusonii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0006.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0043 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Escherichia fergusonii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0043.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0051 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Escherichia fergusonii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0051.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0025 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Flavonifractor plautii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0025.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0034 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Flavonifractor plautii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0034.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0035 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Flavonifractor plautii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0035.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0025 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Flavonifractor plautii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0025.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0034 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Flavonifractor plautii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0034.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0035 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Flavonifractor plautii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0035.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0011 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Parabacteroides distasonis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0011.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0015 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Parabacteroides distasonis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0015.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0018 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Parabacteroides distasonis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0018.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0011 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Parabacteroides distasonis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0011.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0015 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Parabacteroides distasonis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0015.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0018 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Parabacteroides distasonis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0018.raw #COLLECTION CO:COLLECTION_SUMMARY Isolates were obtained via plating of in vitro communities –, derived from CO:COLLECTION_SUMMARY culturing fecal samples from humanized mice –, on agar plates made with CO:COLLECTION_SUMMARY various complex media and frozen as glycerol stocks, as previously described CO:COLLECTION_SUMMARY (Cell Host & Microbe (2022). CO:COLLECTION_SUMMARY https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.chom.2021.12.008, CO:COLLECTION_SUMMARY https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.01.13.523996v1) Frozen stocks were CO:COLLECTION_SUMMARY streaked onto BHI-blood agar plates (5% defibrinated horse blood in 1.5% w/v CO:COLLECTION_SUMMARY agar). Resulting colonies were inoculated into 3 mL of Brain Heart Infusion CO:COLLECTION_SUMMARY (BHI) (BD #2237500) or modified Gifu Anaerobic Medium (mGAM) (HyServe #05433) in CO:COLLECTION_SUMMARY test tubes. All culturing was performed at 37 °C without shaking in an CO:COLLECTION_SUMMARY anaerobic chamber (Coy). To minimize potential physiological changes from CO:COLLECTION_SUMMARY freeze-thaw cycles and changes in growth medium, cultures were diluted 1:200 CO:COLLECTION_SUMMARY every 48 h for 3 passages before growth or metabolomics measurements. After the CO:COLLECTION_SUMMARY first passage, subsequent passages were performed in 96-well polystyrene plates CO:COLLECTION_SUMMARY (Greiner Bio-One #655161) filled with 200 μL of growth medium. CO:SAMPLE_TYPE Bacterial cells #TREATMENT TR:TREATMENT_SUMMARY Many combinations of bacterial isolates were assayed. details can be found in TR:TREATMENT_SUMMARY the publicly available preprint here: TR:TREATMENT_SUMMARY https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.05.30.494065v1.abstract #SAMPLEPREP SP:SAMPLEPREP_SUMMARY Spent media were collected as described above and immediately stored at -80 °C. SP:SAMPLEPREP_SUMMARY Samples were thawed only once, immediately before LC-MS/MS. Thawed samples were SP:SAMPLEPREP_SUMMARY kept on ice, each sample was homogenized by pipetting prior to dispensing. Two SP:SAMPLEPREP_SUMMARY 20-µL aliquots of supernatant were removed from each sample well and dispensed SP:SAMPLEPREP_SUMMARY into two shallow 96-well polypropylene plates, maintained on ice. Additionally, SP:SAMPLEPREP_SUMMARY 5 µL were removed from each sample and combined into a homogenous pool; this SP:SAMPLEPREP_SUMMARY pool was dispensed in 20-µL aliquots and prepared in parallel with samples. SP:SAMPLEPREP_SUMMARY These pooled samples were used for in-run quality control, injected at SP:SAMPLEPREP_SUMMARY predefined intervals over the course of analysis to ensure consistent instrument SP:SAMPLEPREP_SUMMARY performance over time. Samples were analyzed using two complementary SP:SAMPLEPREP_SUMMARY chromatography methods: reversed phase (C18) and hydrophilic interaction SP:SAMPLEPREP_SUMMARY chromatography (HILIC). HILIC data include in this study, C18 data can be found SP:SAMPLEPREP_SUMMARY uploaded in a separate study. All samples were analyzed by positive and negative SP:SAMPLEPREP_SUMMARY mode electrospray ionization (ESI+, ESI-). Sample analysis order was randomized SP:SAMPLEPREP_SUMMARY to minimize potential bias in data acquisition. Procedural blanks were prepared SP:SAMPLEPREP_SUMMARY by extracting 20 µL of water in place of bacterial supernatant. Procedural SP:SAMPLEPREP_SUMMARY blanks were inserted throughout the run as additional quality control. #CHROMATOGRAPHY CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY Bacterial supernatant were analyzed via hydrophilic interaction liquid CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY chromatography (HILIC) coupled to a Thermo Q-Exactive HF high resolution mass CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY spectrometer. Each sample was analyzed in both positive and negative ionization CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY modes (ESI+, ESI-) via subsequent injections. Full MS-ddMS2 data was collected, CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY an inclusion list was used to prioritize MS2 selection of metabolites from our CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY in-house ‘local’ library, when additional scan bandwidth was available MS2 CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY was collected in a data-dependent manner. Mass range was 60-900 mz, resolution CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY was 60k (MS1) and 15k (MS2), centroid data was collected, loop count was 4, CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY isolation window was 1.5 Da. Metabolomics data was processed using MS-DIAL v4.60 CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY (https://www.nature.com/articles/s41587-020-0531-2) and queried against a CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY combination of our in-house MS2 library CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY (https://www.nature.com/articles/s41586-021-03707-9) and MassBank of North CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY America, the largest freely available spectral repository CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY (https://doi.org/10.1002/mas.21535). Annotations were scored using guidelines CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY from the metabolomics standards initiative CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY (https://www.nature.com/articles/nbt0807-846b). Features were excluded from CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY analysis if peak height was not at least 5-fold greater in one or more samples CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY compared to the procedural blank average. CH:INSTRUMENT_NAME Thermo Vanquish CH:COLUMN_NAME Waters Acquity BEH Amide (150 x 2.1mm, 1.7um) CH:COLUMN_TEMPERATURE 45C CH:FLOW_GRADIENT Gradient elution was performed from 100% (B) at 0–2 min to 70% (B) at 7.7 min, CH:FLOW_GRADIENT 40% (B) at 9.5 min, 30% (B) at 10.25 min, 100% (B) at 12.75 min, isocratic until CH:FLOW_GRADIENT 16.75 min with a column flow of CH:FLOW_RATE 0.4 mL/min. CH:SOLVENT_A Water + 10mM ammonium formate + 0.125% formic acid CH:SOLVENT_B 95% acetonitrile + 10mM ammonium formate + 0.125% formic acid CH:CHROMATOGRAPHY_TYPE HILIC #ANALYSIS AN:ANALYSIS_TYPE MS #MS MS:INSTRUMENT_NAME Thermo Q Exactive HF hybrid Orbitrap MS:INSTRUMENT_TYPE Orbitrap MS:MS_TYPE ESI MS:MS_COMMENTS Full MS-ddMS2 data was collected, an inclusion list was used to prioritize MS2 MS:MS_COMMENTS selection of metabolites from our in-house ‘local’ library, when additional MS:MS_COMMENTS scan bandwidth was available MS2 was collected in a data-dependent manner. Mass MS:MS_COMMENTS range was 60-900 mz, resolution was 60k (MS1) and 15k (MS2), centroid data was MS:MS_COMMENTS collected, loop count was 4, isolation window was 1.5 Da. Metabolomics data was MS:MS_COMMENTS processed using MS-DIAL v4.60. Features were excluded from analysis if peak MS:MS_COMMENTS height was not at least 5-fold greater in one or more samples compared to the MS:MS_COMMENTS procedural blank average. MS:ION_MODE POSITIVE MS:MS_RESULTS_FILE ST002832_AN004625_Results.txt UNITS:counts, height Has m/z:Yes Has RT:Yes RT units:Minutes #MS_METABOLITE_DATA MS_METABOLITE_DATA:UNITS Peak height MS_METABOLITE_DATA_START Samples M00179_20220322_Pos_1_MSA0045 M00179_20220322_Pos_1_MSA0046 M00179_20220322_Pos_1_MSA0053 M00179_20220322_Pos_1_MSA0022 M00179_20220322_Pos_1_MSA0025 M00179_20220322_Pos_1_MSA0035 M00179_20220322_Pos_1_MSA0001 M00179_20220322_Pos_1_MSA0005 M00179_20220322_Pos_1_MSA0055 M00179_20220322_Pos_1_MSA0042 M00179_20220322_Pos_1_MSA0063 M00179_20220322_Pos_1_MSA0074 M00179_20220322_Pos_1_MSA0024 M00179_20220322_Pos_1_MSA0032 M00179_20220322_Pos_1_MSA0044 M00179_20220322_Pos_1_MSA0006 M00179_20220322_Pos_1_MSA0033 M00179_20220322_Pos_1_MSA0056 M00179_20220322_Pos_1_MSA0054 M00179_20220322_Pos_1_MSA0062 M00179_20220322_Pos_1_MSA0064 M00179_20220322_Pos_1_MSA0023 M00179_20220322_Pos_1_MSA0039 M00179_20220322_Pos_1_MSA0050 M00179_20220322_Pos_1_MSA0029 M00179_20220322_Pos_1_MSA0047 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3-Methylthiopropylamine 5.116 106.06849 3'-O-Methylcytidine 5.213 258.10828 3'-O-Methylguanosine 5.8 298.11487 3'-O-Methylinosine 4.325 283.10361 3-Pyridinemethanol 1.69 110.05975 3-Ureidopropionic acid 5.522 133.06076 4,6-Diamino-5-formamidopyrimidine 5.276 154.0721 (4-Aminobutyl)guanidine 8.89 131.12903 4-Deoxypyridoxine 4.045 154.08627 4-Guanidinobutyric acid 7.628 146.09206 4-Hydroxyquinoline 1.795 146.05974 4-Imidazoleacetic acid 7.92 127.05006 4-Methyl-5-thiazoleethanol 1.17 144.0475 4-Morpholinopropanesulfonic acid 6.8 210.07899 5,6-Dihydrouracil 1.78 115.04996 5,6-Dimethylbenzimidazole 1.606 147.09163 5'-DEOXYADENOSINE 2.98 252.10904 5-Hydroxyindole 1.117 134.0601 5-Hydroxylysine 9.787 163.10782 5-Methyl-5,6-Dihydrouracil 1.597 129.0658 5-Methylcytosine 5.64 126.06594 5'-Methylthioadenosine 2.62 298.09656 5'-O-Acetyladenosine 2.774 310.11447 6-(gamma,gamma-Dimethylallylamino)purine riboside 1.892 336.16599 7-Keto-8-aminopelargonic acid 6.046 188.12817 7-Methyladenine 3.263 150.07722 7-Methylguanine 5.426 166.0721 Acetyl-carnitine 7.135 204.12321 Acetylcholine cation 3.072 146.11739 Adenine 4.643 136.06151 Adenosine 4.96 268.1033 Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate 7.572 330.05923 Adenosine 3'-monophosphate 9.022 348.07016 Ala-Ala 8.339 161.09193 Ala-Ala-Ala 8.319 232.12933 Ala-Asn 9.223 204.09807 Ala-Asp 8.974 205.08223 Ala-Gln 9.06 218.11337 Ala-Ile 7.664 203.13879 Ala-Leu 7.465 203.13885 Ala-Lys 9.66 218.14984 Alanine 8.103 90.0549 Ala-Phe 7.484 237.12334 Ala-Pro 8.115 187.10774 Ala-Thr 8.682 191.10213 Ala-Trp 7.43 276.13443 Ala-Tyr 7.872 253.11858 .alpha.-L-Glu-L-Tyr 8.353 311.12305 Arg-Ala 9.615 246.15619 Arg-Gln 9.834 303.17734 Arg-Glu 9.78 304.16101 Arg-His 10.087 312.17804 Arginine 9.475 175.11877 Argininosuccinic acid 9.934 291.1301 Arg-Leu 8.674 288.20258 Arg-Lys 10.153 303.21338 Arg-Met 9.073 306.15952 Arg-Pro 9.376 272.17194 Arg-Thr 9.692 276.16626 Arg-Trp 8.679 361.19754 Arg-Tyr 9.239 338.18259 Arg-Val 9.13 274.1868 Asn-Ala 8.869 204.09744 Asn-Arg 9.835 289.16165 Asn-Gln 9.448 261.11893 Asn-Glu 9.321 262.1037 Asn-Lys 9.87 261.15561 Asn-Thr 9.182 234.10823 Asn-Val 8.142 232.12875 Asp-Arg 9.853 290.14621 Asp-Glu 9.516 263.08685 Asp-His 9.854 271.10388 Asp-Ile 8.174 247.129 Asp-Leu 8.008 247.12903 Asp-Phe 8.253 281.11279 Asp-Pro 9.12 231.09746 Asp-Ser 9.702 221.07681 Asp-Val 8.498 233.1134 .beta.-Homoproline 4.363 130.08629 Betaine 7.176 118.08582 Biotin 2.992 245.0952 Cadaverine 9.016 103.12269 Carnosine 9.584 227.11389 Choline cation 5.094 104.10682 Citrulline 8.828 176.10257 Coniferyl aldehyde 1.327 179.08121 Creatine 8.075 154.05869 Creatinine 4.871 114.06583 Cyclocytidine 6.315 226.08224 Cyclo(Leu-Pro) 1.123 211.14398 Cystathionine 9.876 223.07434 Cystine 9.91 241.03116 Cytidine 6.916 244.09264 Cytidine 2',3'-cyclic monophosphoric acid 8.284 306.04797 Cytidine 5'-diphosphocholine 9.869 489.1152 Cytidine 5'-monophosphate 9.308 324.05844 Cytosine 5.843 112.05044 D-Asparagine 8.725 133.06038 Desthiobiotin 2.175 215.13919 D-Glucose 6-phosphate 10.076 261.03729 Dimethylaminopurine 1.852 164.09286 Dimethyl sulfoxide 1.603 79.02122 Diprotin B 6.569 328.22244 DL-.alpha.-Aminopimelic acid 8.092 176.09149 DL-Leu-Val 6.703 231.1703 DL-Norleucinamide 5.937 131.11781 DL-Phenylalanine 6.892 166.08569 Dopamine 6.2 154.08612 ectoine 7.831 143.08147 .epsilon.-Caprolactam 1.293 114.09132 Ethanolamine 7.272 62.06015 Galactosamine 8.377 180.08658 .gamma.-Aminobutyric acid 7.793 104.07047 gamma-Glutamylmethionine 8.482 279.10086 gamma-Glutamyltyrosine 8.601 311.12369 Gln-Ala 8.739 218.11372 Gln-Arg 9.628 303.17715 Gln-Gln 9.349 275.13519 Gln-Glu 9.246 276.11862 Gln-Gly 9.086 204.09822 Gln-Ser 9.329 234.1086 Gln-Thr 9.035 248.1243 Gln-Val 7.893 246.14485 Glu-Ala 8.814 219.09767 Glu-Asn 9.52 262.10352 Glucosamine 9.117 180.08629 Glucose-1-phosphate 9.651 261.03708 Glu-Gln 9.388 276.11884 Glu-His 9.786 285.1196 Glu-Phe 8.138 295.12881 Glu-Ser 9.464 235.09258 Glutamic acid 8.776 148.05986 Glutathione (reduced) 9.059 308.09134 Glu-Thr 9.135 249.10767 Gly-Arg 9.768 232.14058 Glycerophosphocholine 8.602 258.10928 Glycitein 1.128 285.07568 Glycyl-L-4-hydroxyproline 8.79 189.08684 Gly-Glu 9.128 205.08212 Gly-His 9.729 213.09822 Gly-Leu 7.797 189.12344 Gly-Lys 9.8 204.13435 Gly-Met 7.925 207.07993 Gly-Phe 7.649 223.10713 Gly-Pro-Ala 8.271 244.12946 Gly-Pro-Arg 9.513 329.1933 Gly-Ser 9.313 163.07149 Gly-Thr 8.978 177.08656 Gly-Tyr 8.139 239.10051 Gly-Val 7.956 175.1073 Guanine 6.501 152.05641 Guanosine 7.224 284.09863 Guanosine 3',5'-cyclic monophosphate 8.367 346.05423 Guanosine 5'-monophosphate 9.401 364.06458 His-Ala 9.349 227.11394 His-Asn 9.762 270.11911 His-Gln 9.665 284.13535 His-Glu 9.623 285.11914 His-Gly 9.542 213.0984 His-Ile 8.268 269.16037 His-Leu 8.147 269.16086 His-Lys 10.074 284.17188 His-Met 8.536 287.11688 His-Phe 8.045 303.14551 His-Pro 9.191 253.12917 His-Ser 9.684 243.10838 Histamine 8.253 112.08687 His-Thr 9.479 257.12433 Histidine 9.378 156.07661 Histidinol 8.404 142.09734 His-Tyr 8.735 319.13983 His-Val 8.668 255.14465 Homoarginine 9.37 189.12337 Hypoxanthine 4.944 137.04543 Ile-Arg 8.928 288.20267 Ile-Asn 8.242 246.14441 Ile-Gln 8.105 260.15994 Ile-Glu 8.015 261.14392 Ile-His 8.81 269.16104 Ile-Ile 6.112 245.18536 Ile-Lys 9.056 260.19632 Ile-Met 6.81 263.13904 Ile-Pro-Ile 6.118 342.23825 Ile-Ser 8.045 219.13397 Ile-Trp 6.28 318.18088 Ile-Tyr 7.12 295.16516 Ile-Val 6.808 231.16991 Indole-3-carboxaldehyde 1.083 146.06003 Inosine 6.292 269.08783 Isobutyric acid 1.672 89.07082 Isoleucine 7.21 132.1015 Isopentenyladenine 1.734 204.12442 Kynurenine 6.826 209.103 L-Anserine 9.521 241.12881 L-Aspartic acid 9.216 134.04445 L-Cysteine-glutathione disulfide 10.117 427.09528 Leu-Arg 8.785 288.20285 Leu-Asn 8.121 246.14436 Leucine 7.02 132.10144 Leu-Gln 8.008 260.16013 Leu-Glu 7.937 261.14398 Leu-Gly-Leu 6.674 302.2063 Leu-His 8.697 269.16086 Leu-Lys 8.918 260.19702 Leu-Phe 6.252 279.16998 Leu-Ser 7.915 219.13399 Leu-Tyr 7.037 295.16522 L-Glutamine 8.624 147.07613 L-Homocitrulline 8.7 190.11823 L-Hydroxyarginine 9.66 191.1138 L-Pyroglutamic acid 7.864 259.09207 L-Saccharopine 9.816 277.13901 L-Threonine 8.29 120.06519 L-Tyrosine, ethyl ester 3.809 210.11255 L-Valinamide 6.271 117.10212 Lys-Ala 9.521 218.14998 Lys-Gln 9.833 275.17172 Lys-Glu 9.79 276.15567 Lysine 9.555 147.11221 Lys-Leu 8.817 260.19662 Lys-Lys 10.16 275.20789 Lys-Met 9.11 278.15292 Lys-Phe 8.746 294.18097 Lys-Pro 9.523 244.16565 Lys-Thr 9.741 248.16054 Lys-Trp 8.75 333.19156 Lys-Tyr 9.287 310.17606 Lys-Val 9.176 246.18106 Melamine 5.557 127.07263 Met-Glu 8.194 279.10107 Methacholine cation 6.494 160.13315 Methionine 7.437 150.05791 Methioninesulfoxide 8.544 166.05278 Met-His 8.996 287.11728 Met-Leu 6.387 263.14249 Met-Phe 6.423 297.12671 Met-Pro 7.425 247.11134 Met-Val 7.012 249.12689 N1,N12-Diacetylspermine 8.478 287.24435 N-[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]acetamide 1.146 180.10185 N2-Methylguanosine 6.535 298.11432 N-(2-phenylethyl)acetamide 1.089 164.10687 N6-Methyladenosine 3.519 282.11923 N6,N6-dimethyllysine 9.189 175.14374 N8-Acetylspermidine 8.856 188.17552 N-Acetylhistamine 6.016 154.09735 N-Acetylhistidine 8.121 198.08716 N-Acetyl-leucine 2.085 174.1122 N-Acetyl-L-methionine 3.118 192.06871 N-Acetylneuraminic acid 9.333 310.11292 N-Acetylphenylalanine 2.514 208.0968 N-Acetyltryptophan 2.758 247.10739 N-alpha-Acetyl-L-ornithine 8.395 175.10771 N-epsilon-Acetyllysine 8.079 189.12312 N.epsilon.-Methyl-L-lysine 9.317 161.12825 NEPSILON,NEPSILON,NEPSILON-TRIMETHYLLYSINE 9.233 189.15945 Niacinamide 1.734 123.05489 Nicotinamide riboside cation 7.458 255.09744 Nicotinic acid 3.903 124.03893 N-Methyl-L-proline 7.238 130.0863 N-Methyl-L-threonine 7.853 134.08102 N,N-Diethyl-2-aminoethanol 4.78 118.12261 N,N-Dimethylarginine 8.949 203.1501 N,N-Dimethyldodecylamine N-oxide 2.051 230.24802 N,N-Dimethylguanosine 5.599 312.1301 Norharmane 2.097 169.07561 O-Acetylserine 7.828 148.06015 O-Phosphocholine 9.631 184.07317 OPHTHALMIC ACID 8.978 290.13403 Ornithine 9.605 133.09677 Pantothenic acid 3.428 220.11743 Pentaethylene glycol 1.722 239.14903 Phe-Ala 7.296 237.12338 Phe-Arg 8.667 322.18716 Phe-Asp 7.828 281.11328 Phe-Gln 7.935 294.14511 Phe-Glu 7.872 295.12912 Phe-Gly 7.571 223.10777 Phe-His 8.595 303.14539 Phe-Leu 5.686 279.17035 Phe-Lys 8.862 294.181 Phenylacetaldehyde 5.411 121.0647 Phe-Phe 5.807 313.15451 Phe-Trp 5.874 352.16541 Phe-Val 6.135 265.15417 Phosphoserine 9.878 186.01613 Pipecolic acid 7.551 130.08623 Pro-Ala 7.903 187.1077 Pro-Asn 8.853 230.11356 Pro-Asp 8.568 231.09711 Pro-Gln 8.67 244.12885 Pro-Glu 8.482 245.11346 Pro-Leu 7.123 229.15456 Prolinamide 6.452 115.08659 Proline 7.799 116.07056 Proline-hydroxyproline 8.615 229.11836 Pro-Lys 9.446 244.16559 Pro-Met 7.558 247.1113 Pro-Phe 7.008 263.13904 Propionylcarnitine 6.335 218.13863 Pro-Pro 7.898 213.1234 Pro-Ser 8.607 203.10275 Pro-Thr 8.244 217.11807 Pro-Trp 6.994 302.14993 Pro-Val 7.674 215.13887 Pterine 5.277 164.05672 P-Toluenesulfonic acid 8.962 173.02094 Purine 2.417 121.0507 Putrescine 9.248 89.10725 pyridine 6.563 80.04943 Pyridoxal 2.185 168.06549 Pyridoxamine 7.986 169.09692 Pyridoxine 3.77 170.08122 PyroGlu-Trp 5.97 316.12872 Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione, hexahydro-3-(1-methylethyl)- 1.157 197.12846 Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione, hexahydro-3-[(4-hydroxyphenyl)methyl]- 1.663 261.12289 Quinoline-2,8-diol 1.748 162.06593 (R)-Butyrylcarnitine 5.705 232.15448 Riboflavin 6.14 377.14557 S-Adenosyl-homocysteine 8.778 385.12827 S-Adenosyl-methionine 9.728 399.14517 S-Carboxymethyl-L-cysteine 8.991 180.03249 Ser-Arg 9.838 262.15134 Ser-Asp 9.397 221.07704 Ser-Gln 9.428 234.108 Ser-Glu 9.297 235.09261 Ser-Gly 9.187 163.07143 Ser-His 9.793 243.10902 Serine 8.671 106.04958 Ser-Lys 9.863 234.14499 Ser-Met 8.099 237.09041 Ser-Ser 9.433 193.08217 Ser-Thr 9.149 207.0977 Ser-Val 8.123 205.11794 Spermine 6.951 203.22275 Stachydrine 7.065 144.1019 Tetraethylene glycol 1.652 195.12241 Thiamine cation 6.834 265.11157 Thr-Ala 8.496 191.10278 Thr-Asp 9.126 235.0927 Thr-Gln 9.189 248.12387 Thr-Glu 9.029 249.1084 Thr-Gly 8.818 177.08708 Thr-His 9.635 257.12457 Thr-Leu 7.678 233.14961 Thr-Phe 7.49 267.13397 Thr-Thr 8.822 221.11285 Thr-Tyr 8.009 283.12802 Thr-Val 7.799 219.13423 Thr-Val-Leu 7.054 332.21802 Thymine 2.146 127.05025 trans-4-Hydroxy-L-proline 8.079 132.07649 Trehalose 8.987 360.14926 Triethylene glycol monobutyl ether 1.074 207.16064 Trigonelline 7.423 138.05469 Trimethylamine N-oxide (TMAO) 5.455 76.07565 Trp-Gly 7.564 262.11877 Trp-Leu 6.077 318.18143 Tryptamine 5.012 161.10713 Tryptophan 6.869 205.0966 tryptophan ethyl ester 3.266 233.12849 Tyramine 5.614 138.09097 Tyr-Gln 8.481 310.13895 Tyr-Gly 8.044 239.10265 Tyr-His 9.149 319.14023 Tyr-Ile 6.78 295.16534 Tyrosine 7.686 182.08096 Tyr-Phe 6.707 329.14978 Tyr-Pro 7.462 279.13403 Tyr-Tyr 7.457 345.1441 Tyr-Val 7.3 281.14969 Uracil 2.439 113.03443 Urea 2.765 61.03983 Uridine 5'-monophosphate 9.149 325.04279 Urocanic acid 3.572 139.05002 Val-Arg 9.253 274.18689 Val-Asn 8.587 232.12933 Val-Asp 8.334 233.11269 Val-Gln 8.437 246.14427 Val-Glu 8.308 247.12827 Val-Gly 8.247 175.10736 Val-His 9.158 255.14523 Valine 7.796 118.08606 Val-Lys 9.332 246.18124 Val-Met 7.286 249.1268 Val-Phe 6.688 265.1539 Val-Pro 7.546 215.13879 Val-Ser 8.342 205.11841 Val-Trp 6.682 304.16501 Val-Tyr 7.551 281.14935 Val-Val 7.392 217.15419 Xanthine 5.654 153.04056 Xanthosine 7.382 285.08276 METABOLITES_END #END