#METABOLOMICS WORKBENCH bcdefelice_20230824_084726 DATATRACK_ID:4245 STUDY_ID:ST002832 ANALYSIS_ID:AN004626 PROJECT_ID:PR001774 VERSION 1 CREATED_ON 06-05-2025 #PROJECT PR:PROJECT_TITLE Resource competition predicts assembly of in vitro gut bacterial communities PR:PROJECT_SUMMARY Microbiota dynamics arise from a plethora of interspecies interactions, PR:PROJECT_SUMMARY including resource competition, cross-feeding, and pH modulation. The individual PR:PROJECT_SUMMARY contributions of these mechanisms are challenging to untangle, especially in PR:PROJECT_SUMMARY natural or complex laboratory environments where the landscape of resource PR:PROJECT_SUMMARY competition is unclear. Here, we developed a framework to estimate the extent of PR:PROJECT_SUMMARY multi-species niche overlaps by combining metabolomics data of individual PR:PROJECT_SUMMARY species, growth measurements in pairwise spent media, and mathematical models. PR:PROJECT_SUMMARY When applied to an in vitro model system of human gut commensals in complex PR:PROJECT_SUMMARY media, our framework revealed that a simple model of resource competition PR:PROJECT_SUMMARY described most pairwise interactions. By grouping metabolomic features depleted PR:PROJECT_SUMMARY by the same set of species, we constructed a coarse-grained consumer-resource PR:PROJECT_SUMMARY model that predicted assembly compositions to reasonable accuracy. Moreover, PR:PROJECT_SUMMARY deviations from model predictions enabled us to identify and incorporate into PR:PROJECT_SUMMARY the model additional interactions, including pH-mediated effects and PR:PROJECT_SUMMARY cross-feeding, which improved model performance. In sum, our work provides an PR:PROJECT_SUMMARY experimental and theoretical framework to dissect microbial interactions in PR:PROJECT_SUMMARY complex in vitro environments. PR:INSTITUTE Stanford University PR:LAST_NAME DeFelice PR:FIRST_NAME Brian PR:ADDRESS 1291 Welch Rd., Rm. G0821 (SIM1), Stanford CA, California, 94305, USA PR:EMAIL bcdefelice@ucdavis.edu PR:PHONE 5303564485 PR:DOI http://dx.doi.org/10.21228/M8DB1F #STUDY ST:STUDY_TITLE Resource competition predicts assembly of in vitro gut bacterial communities- ST:STUDY_TITLE HILIC ST:STUDY_SUMMARY Microbiota dynamics arise from a plethora of interspecies interactions, ST:STUDY_SUMMARY including resource competition, cross-feeding, and pH modulation. The individual ST:STUDY_SUMMARY contributions of these mechanisms are challenging to untangle, especially in ST:STUDY_SUMMARY natural or complex laboratory environments where the landscape of resource ST:STUDY_SUMMARY competition is unclear. Here, we developed a framework to estimate the extent of ST:STUDY_SUMMARY multi-species niche overlaps by combining metabolomics data of individual ST:STUDY_SUMMARY species, growth measurements in pairwise spent media, and mathematical models. ST:STUDY_SUMMARY When applied to an in vitro model system of human gut commensals in complex ST:STUDY_SUMMARY media, our framework revealed that a simple model of resource competition ST:STUDY_SUMMARY described most pairwise interactions. By grouping metabolomic features depleted ST:STUDY_SUMMARY by the same set of species, we constructed a coarse-grained consumer-resource ST:STUDY_SUMMARY model that predicted assembly compositions to reasonable accuracy. Moreover, ST:STUDY_SUMMARY deviations from model predictions enabled us to identify and incorporate into ST:STUDY_SUMMARY the model additional interactions, including pH-mediated effects and ST:STUDY_SUMMARY cross-feeding, which improved model performance. In sum, our work provides an ST:STUDY_SUMMARY experimental and theoretical framework to dissect microbial interactions in ST:STUDY_SUMMARY complex in vitro environments. ST:INSTITUTE Stanford University ST:LAST_NAME DeFelice ST:FIRST_NAME Brian ST:ADDRESS 1291 Welch Rd. ST:EMAIL bcdefelice@ucdavis.edu ST:PHONE 5303564485 ST:SUBMIT_DATE 2023-08-24 #SUBJECT SU:SUBJECT_TYPE Bacteria SU:SUBJECT_SPECIES Bacteroides thetaiotaomicron SU:TAXONOMY_ID 818 SU:SUBJECT_COMMENTS Fecal derived communities and isolates, supernatant was assayed SU:SPECIES_GROUP Bacteria #SUBJECT_SAMPLE_FACTORS: SUBJECT(optional)[tab]SAMPLE[tab]FACTORS(NAME:VALUE pairs separated by |)[tab]Additional sample data SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - M00179_20220322_Neg_1_MSA0045 Genotype:bacterial community | Treatment:15-member community timepoint 1 RAW_FILE_NAME=M00179_20220322_Neg_1_MSA0045.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - M00179_20220322_Neg_1_MSA0046 Genotype:bacterial community | Treatment:15-member community timepoint 1 RAW_FILE_NAME=M00179_20220322_Neg_1_MSA0046.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - M00179_20220322_Neg_1_MSA0053 Genotype:bacterial community | Treatment:15-member community timepoint 1 RAW_FILE_NAME=M00179_20220322_Neg_1_MSA0053.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - M00179_20220322_Pos_1_MSA0045 Genotype:bacterial community | Treatment:15-member community timepoint 1 RAW_FILE_NAME=M00179_20220322_Pos_1_MSA0045.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - 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metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0002 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Clostridium symbiosum RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0002.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0045 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Clostridium symbiosum RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0045.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0047 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Clostridium symbiosum RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0047.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0002 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Clostridium symbiosum RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0002.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0045 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Clostridium symbiosum RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0045.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0047 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Clostridium symbiosum RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0047.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0008 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecalis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0008.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0052 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecalis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0052.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0056 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecalis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0056.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0008 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecalis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0008.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0052 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecalis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0052.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0056 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecalis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0056.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0020 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecium RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0020.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0023 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecium RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0023.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0048 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecium RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0048.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0020 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecium RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0020.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0023 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecium RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0023.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0048 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus faecium RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0048.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0005 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus hirae RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0005.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0017 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus hirae RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0017.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0046 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus hirae RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0046.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0005 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus hirae RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0005.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0017 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus hirae RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0017.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0046 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Enterococcus hirae RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0046.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0006 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Escherichia fergusonii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0006.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0043 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Escherichia fergusonii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0043.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0051 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Escherichia fergusonii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0051.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0006 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Escherichia fergusonii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0006.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0043 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Escherichia fergusonii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0043.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0051 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Escherichia fergusonii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0051.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0025 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Flavonifractor plautii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0025.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0034 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Flavonifractor plautii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0034.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0035 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Flavonifractor plautii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0035.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0025 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Flavonifractor plautii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0025.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0034 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Flavonifractor plautii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0034.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0035 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Flavonifractor plautii RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0035.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0011 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Parabacteroides distasonis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0011.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0015 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Parabacteroides distasonis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0015.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0018 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Parabacteroides distasonis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Neg_1_MSA0018.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0011 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Parabacteroides distasonis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0011.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0015 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Parabacteroides distasonis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0015.raw SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0018 Genotype:bacterial community | Treatment:mGAM spent by Parabacteroides distasonis RAW_FILE_NAME=metaboproj_165H_20220125_Pos_1_MSA0018.raw #COLLECTION CO:COLLECTION_SUMMARY Isolates were obtained via plating of in vitro communities –, derived from CO:COLLECTION_SUMMARY culturing fecal samples from humanized mice –, on agar plates made with CO:COLLECTION_SUMMARY various complex media and frozen as glycerol stocks, as previously described CO:COLLECTION_SUMMARY (Cell Host & Microbe (2022). CO:COLLECTION_SUMMARY https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.chom.2021.12.008, CO:COLLECTION_SUMMARY https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.01.13.523996v1) Frozen stocks were CO:COLLECTION_SUMMARY streaked onto BHI-blood agar plates (5% defibrinated horse blood in 1.5% w/v CO:COLLECTION_SUMMARY agar). Resulting colonies were inoculated into 3 mL of Brain Heart Infusion CO:COLLECTION_SUMMARY (BHI) (BD #2237500) or modified Gifu Anaerobic Medium (mGAM) (HyServe #05433) in CO:COLLECTION_SUMMARY test tubes. All culturing was performed at 37 °C without shaking in an CO:COLLECTION_SUMMARY anaerobic chamber (Coy). To minimize potential physiological changes from CO:COLLECTION_SUMMARY freeze-thaw cycles and changes in growth medium, cultures were diluted 1:200 CO:COLLECTION_SUMMARY every 48 h for 3 passages before growth or metabolomics measurements. After the CO:COLLECTION_SUMMARY first passage, subsequent passages were performed in 96-well polystyrene plates CO:COLLECTION_SUMMARY (Greiner Bio-One #655161) filled with 200 μL of growth medium. CO:SAMPLE_TYPE Bacterial cells #TREATMENT TR:TREATMENT_SUMMARY Many combinations of bacterial isolates were assayed. details can be found in TR:TREATMENT_SUMMARY the publicly available preprint here: TR:TREATMENT_SUMMARY https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.05.30.494065v1.abstract #SAMPLEPREP SP:SAMPLEPREP_SUMMARY Spent media were collected as described above and immediately stored at -80 °C. SP:SAMPLEPREP_SUMMARY Samples were thawed only once, immediately before LC-MS/MS. Thawed samples were SP:SAMPLEPREP_SUMMARY kept on ice, each sample was homogenized by pipetting prior to dispensing. Two SP:SAMPLEPREP_SUMMARY 20-µL aliquots of supernatant were removed from each sample well and dispensed SP:SAMPLEPREP_SUMMARY into two shallow 96-well polypropylene plates, maintained on ice. Additionally, SP:SAMPLEPREP_SUMMARY 5 µL were removed from each sample and combined into a homogenous pool; this SP:SAMPLEPREP_SUMMARY pool was dispensed in 20-µL aliquots and prepared in parallel with samples. SP:SAMPLEPREP_SUMMARY These pooled samples were used for in-run quality control, injected at SP:SAMPLEPREP_SUMMARY predefined intervals over the course of analysis to ensure consistent instrument SP:SAMPLEPREP_SUMMARY performance over time. Samples were analyzed using two complementary SP:SAMPLEPREP_SUMMARY chromatography methods: reversed phase (C18) and hydrophilic interaction SP:SAMPLEPREP_SUMMARY chromatography (HILIC). HILIC data include in this study, C18 data can be found SP:SAMPLEPREP_SUMMARY uploaded in a separate study. All samples were analyzed by positive and negative SP:SAMPLEPREP_SUMMARY mode electrospray ionization (ESI+, ESI-). Sample analysis order was randomized SP:SAMPLEPREP_SUMMARY to minimize potential bias in data acquisition. Procedural blanks were prepared SP:SAMPLEPREP_SUMMARY by extracting 20 µL of water in place of bacterial supernatant. Procedural SP:SAMPLEPREP_SUMMARY blanks were inserted throughout the run as additional quality control. #CHROMATOGRAPHY CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY Bacterial supernatant were analyzed via hydrophilic interaction liquid CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY chromatography (HILIC) coupled to a Thermo Q-Exactive HF high resolution mass CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY spectrometer. Each sample was analyzed in both positive and negative ionization CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY modes (ESI+, ESI-) via subsequent injections. Full MS-ddMS2 data was collected, CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY an inclusion list was used to prioritize MS2 selection of metabolites from our CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY in-house ‘local’ library, when additional scan bandwidth was available MS2 CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY was collected in a data-dependent manner. Mass range was 60-900 mz, resolution CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY was 60k (MS1) and 15k (MS2), centroid data was collected, loop count was 4, CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY isolation window was 1.5 Da. Metabolomics data was processed using MS-DIAL v4.60 CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY (https://www.nature.com/articles/s41587-020-0531-2) and queried against a CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY combination of our in-house MS2 library CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY (https://www.nature.com/articles/s41586-021-03707-9) and MassBank of North CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY America, the largest freely available spectral repository CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY (https://doi.org/10.1002/mas.21535). Annotations were scored using guidelines CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY from the metabolomics standards initiative CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY (https://www.nature.com/articles/nbt0807-846b). Features were excluded from CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY analysis if peak height was not at least 5-fold greater in one or more samples CH:CHROMATOGRAPHY_SUMMARY compared to the procedural blank average. CH:INSTRUMENT_NAME Thermo Vanquish CH:COLUMN_NAME Waters Acquity BEH Amide (150 x 2.1mm, 1.7um) CH:COLUMN_TEMPERATURE 45C CH:FLOW_GRADIENT Gradient elution was performed from 100% (B) at 0–2 min to 70% (B) at 7.7 min, CH:FLOW_GRADIENT 40% (B) at 9.5 min, 30% (B) at 10.25 min, 100% (B) at 12.75 min, isocratic until CH:FLOW_GRADIENT 16.75 min with a column flow of CH:FLOW_RATE 0.4 mL/min. CH:SOLVENT_A Water + 10mM ammonium formate + 0.125% formic acid CH:SOLVENT_B 95% acetonitrile + 10mM ammonium formate + 0.125% formic acid CH:CHROMATOGRAPHY_TYPE HILIC #ANALYSIS AN:ANALYSIS_TYPE MS #MS MS:INSTRUMENT_NAME Thermo Q Exactive HF hybrid Orbitrap MS:INSTRUMENT_TYPE Orbitrap MS:MS_TYPE ESI MS:MS_COMMENTS Full MS-ddMS2 data was collected, an inclusion list was used to prioritize MS2 MS:MS_COMMENTS selection of metabolites from our in-house ‘local’ library, when additional MS:MS_COMMENTS scan bandwidth was available MS2 was collected in a data-dependent manner. Mass MS:MS_COMMENTS range was 60-900 mz, resolution was 60k (MS1) and 15k (MS2), centroid data was MS:MS_COMMENTS collected, loop count was 4, isolation window was 1.5 Da. Metabolomics data was MS:MS_COMMENTS processed using MS-DIAL v4.60. Features were excluded from analysis if peak MS:MS_COMMENTS height was not at least 5-fold greater in one or more samples compared to the MS:MS_COMMENTS procedural blank average. MS:ION_MODE NEGATIVE MS:MS_RESULTS_FILE ST002832_AN004626_Results.txt UNITS:counts, height Has m/z:Yes Has RT:Yes RT units:Minutes #MS_METABOLITE_DATA MS_METABOLITE_DATA:UNITS Peak height MS_METABOLITE_DATA_START Samples M00179_20220322_Neg_1_MSA0045 M00179_20220322_Neg_1_MSA0046 M00179_20220322_Neg_1_MSA0053 M00179_20220322_Neg_1_MSA0022 M00179_20220322_Neg_1_MSA0025 M00179_20220322_Neg_1_MSA0035 M00179_20220322_Neg_1_MSA0001 M00179_20220322_Neg_1_MSA0005 M00179_20220322_Neg_1_MSA0055 M00179_20220322_Neg_1_MSA0042 M00179_20220322_Neg_1_MSA0063 M00179_20220322_Neg_1_MSA0074 M00179_20220322_Neg_1_MSA0024 M00179_20220322_Neg_1_MSA0032 M00179_20220322_Neg_1_MSA0044 M00179_20220322_Neg_1_MSA0006 M00179_20220322_Neg_1_MSA0033 M00179_20220322_Neg_1_MSA0056 M00179_20220322_Neg_1_MSA0054 M00179_20220322_Neg_1_MSA0062 M00179_20220322_Neg_1_MSA0064 M00179_20220322_Neg_1_MSA0023 M00179_20220322_Neg_1_MSA0039 M00179_20220322_Neg_1_MSA0050 M00179_20220322_Neg_1_MSA0029 M00179_20220322_Neg_1_MSA0047 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Ala-Arg 9.616 244.14085 Ala-Asn 9.236 202.08282 Ala-Asp 8.968 203.06679 Ala-Gln 9.057 216.09866 Ala-Glu 8.873 217.08266 Ala-Leu 7.671 201.12387 Ala-Lys 9.647 216.13513 Alanine 8.102 88.04021 Ala-Phe 7.482 235.10826 Ala-Pro 8.103 185.09259 Ala-Ser 8.988 175.07191 Ala-Thr 8.681 189.08794 Ala-Trp 7.428 274.11935 Ala-Tyr 7.862 251.10307 Ala-Val 7.79 187.10823 Allantoin 5.676 157.03642 .alpha.-Hydroxyisobutyric acid 2.455 103.04002 .alpha.-L-Glu-L-Asp 9.367 261.07214 Anserine 9.538 239.11476 Arg-Asp 9.856 288.1312 Arg-Gln 9.836 301.16263 Arginine 9.476 173.1039 Arg-Leu 8.674 286.18826 Arg-Lys 10.152 301.19907 Arg-Val 9.131 272.17264 Asn-Ala 8.865 202.0831 Asn-Asp 9.419 246.07253 Asn-Gln 9.453 259.104 Asn-Lys 9.878 259.1409 Asn-Thr 9.175 232.09328 Asn-Val 8.13 230.11447 Asp-Asp 9.643 247.05656 Asp-Glu 9.526 261.0726 Asp-Met 8.675 263.07001 Asp-Phe 8.207 279.09778 Asp-Pro 9.087 229.08247 Asp-Ser 9.699 219.06165 Asp-Val 8.708 231.09793 Azelaic acid 1.477 187.09718 .beta.-Glycerophosphate 8.965 171.00633 Biotin 2.847 243.08055 Carnosine 9.579 225.09868 Citraconic acid (2-methylmalate) 1.705 129.0193 Citramalic acid 9.335 147.02991 Citric acid 9.385 191.01964 Citrulline 8.829 174.08806 Cordycepin 4.891 250.09793 Creatinine 5.003 112.05148 Cysteic acid 9.052 167.99702 Cystine 9.918 239.01624 Cytidine 2',3'-cyclic monophosphoric acid 8.289 304.03372 Cytidine-5'-monophosphate 9.472 322.04391 Daidzein 1.148 253.05008 D-Arabinonic acid 8.321 165.04018 D-(+)-Arabitol 7.034 151.06081 D-Asparagine 8.723 131.04602 D-Fructose-6-phosphate 9.355 259.03299 D-Glucose-6-phosphate 10.066 259.02176 D-Glucuronic acid 9.256 193.03505 Dihydroxyacetone phosphate 8.598 168.981 Diprotin B 6.581 326.20831 DL-.alpha.-Aminopimelic acid 8.088 174.0769 DL-Cystathionine 9.876 221.05991 DL-Indole-3-lactic acid 2.123 204.06619 DL-Phenylalanine 6.9 164.07146 D-Pantothenic acid 3.422 218.1031 D-(+)-Trehalose 8.98 341.10861 Ethylmalonic acid 2.415 131.03485 Ethyl sulfate 1.834 124.99119 Galactinol 9.728 387.11423 gamma-Glutamylglutamine 9.397 274.10373 gamma-Glutamylmethionine 8.243 277.08649 gamma-Glutamyltyrosine 8.601 309.10861 Gln-Thr 9.03 246.10953 Gln-Val 8.111 244.1302 Glu-Ala 8.716 217.0829 Glu-Arg 9.773 302.14673 Glu-Asn 9.547 260.08813 Glucose 7.593 179.05586 Glucose-1-phosphate 9.654 259.02176 Glu-Gln 9.59 274.10449 Glu-Pro 8.668 243.09795 Glu-Ser 9.523 233.07764 Glutamic acid 8.776 146.04559 Glutaric acid 2.756 131.0349 Glutathione, oxidized 10.184 611.14459 Glutathione (reduced) 9.059 306.07663 Glu-Thr 9.03 247.09346 Gly-Arg 9.749 230.12515 Gly-Asn 9.452 188.06711 Gly-Asp 9.246 189.05151 Glyceraldehyde 7.816 89.0243 Glyceric acid 8.099 105.01929 Glycolic acid 7.292 75.00859 Glycyl-L-proline 8.559 171.07698 Gly-Glu 9.127 203.06689 Gly-His 9.729 211.08305 Gly-Lys 9.797 202.11922 Gly-Met 7.905 205.06462 Gly-Pro-Ala 8.277 242.11398 Gly-Tyr 8.117 237.08792 Gly-Val 7.948 173.09256 Guanine 6.498 150.04201 Guanosine 7.228 282.08435 Guanosine-3',5'-cyclic monophosphate 8.361 344.04028 Guanosine 5'-monophosphate 9.403 362.05048 Hippuric acid 3.009 178.05075 His-Ala 9.348 225.09869 His-Asn 9.753 268.10492 His-Asp 9.757 269.08893 His-Gln 9.658 282.12006 His-Glu 9.615 283.10458 His-Gly 9.547 211.0831 His-His 9.957 291.12039 His-Ile 8.266 267.14627 His-Leu 8.139 267.14551 His-Lys 10.07 282.15643 His-Pro 9.267 251.11429 His-Ser 9.687 241.0941 His-Thr 9.487 255.10963 Histidine 9.383 154.06181 His-Val 8.666 253.13052 Homogentisic acid 2.748 167.03459 Hypoxanthine 4.946 135.03104 Ile-Arg 8.929 286.18823 Ile-Asp 8.069 245.11359 Ile-Gln 8.102 258.14578 Ile-Glu 8.021 259.12964 Ile-Gly-Ile 7.191 300.19254 Ile-His 8.813 267.14603 Ile-Met 6.853 261.12378 Ile-Phe 6.256 277.15567 Ile-Pro-Ile 6.233 340.22379 Ile-Ser 8.045 217.11864 Ile-Trp 6.278 316.16602 Ile-Tyr 7.032 293.15079 Indoxyl sulfate 1.36 212.00209 Inosine 6.291 267.07352 ISOCITRIC ACID 8.116 191.01962 Isoleucine 7.211 130.08714 Isopentenyladenine 1.686 202.10982 Lactic acid 3.602 89.02435 Lactobionic acid 9.619 357.10333 Lactose 8.739 387.11346 L-ASPARTATE 9.215 132.02998 L-Cysteine-glutathione disulfide 10.124 425.08035 L-Cysteinesulfinic acid 9.287 152.00192 Leu-Arg 8.792 286.18793 Leu-Asn 8.25 244.13011 Leu-Gln 8.006 258.14563 Leu-Glu 7.941 259.12964 Leu-Gly-Leu 7.022 300.19196 Leu-His 8.696 267.14548 Leu-Leu 6.11 243.17064 Leu-Met 6.714 261.12778 Leu-Pro 7.195 227.13956 Leu-Pro-Leu 6.084 340.22382 Leu-Ser 7.912 217.11865 Leu-Thr 7.78 231.13435 Leu-Val 6.708 229.155 L-.gamma.-Glutamyl-L-glutamic acid 9.242 275.08847 L-Glutamine 8.631 145.06139 L-Homocitrulline 8.639 188.10371 L-Leucine 7.025 130.08713 L-Methionine 7.442 148.04344 L-Pyroglutamic acid 7.865 257.078 L-Saccharopine 9.818 275.12473 L-Tyrosine 7.718 180.05936 Lys-Gln 9.828 273.15622 Lys-Glu 9.79 274.1402 Lys-Ile 9.051 258.18201 Lysine 9.556 145.09798 Lys-Leu 8.828 258.18201 Lys-Lys 10.16 273.19305 Lys-Phe 8.75 292.1665 Lys-Pro 9.472 242.15028 Lys-Tyr 9.301 308.16125 Lys-Val 9.181 244.16603 Malic acid 9.213 133.01405 Malonic acid 4.624 103.00343 Maltose 8.715 341.10797 Maltotetraose 10.021 711.21942 Maltotriose 9.623 549.16638 Mannose 7.816 179.05569 Met-Asp 8.239 263.07059 Methioninesulfoxide 8.545 164.03848 Met-His 8.991 285.10193 Met-Ile 6.363 261.1272 Met-Met 6.99 279.08344 Met-Phe 6.421 295.11151 Met-Pro 7.455 245.09586 Met-Thr 7.875 249.09087 Met-Val 7.01 247.1115 Mevalonic acid 2.712 147.06607 Mucic acid 9.869 209.02983 N2-Methylguanosine 6.518 296.09988 N2,N2-Dimethylguanosine 5.575 310.11505 N-Acetylalanine 4.727 130.05093 N-Acetyl-aspartic acid 7.618 174.04057 N-Acetylgalactoseamine 7.429 220.08269 N-Acetylglucosamine 7.215 220.08266 N-Acetylglycine 7.407 116.03508 N-Acetylhistidine 8.115 196.07271 N-ACETYL-L-LEUCINE 2.078 172.09773 N-Acetyl-L-methionine 3.116 190.05415 N-Acetyl-L-tyrosine 4.835 222.07716 N-Acetylneuraminic acid 9.368 308.09857 N-Acetylphenylalanine 2.486 206.0822 N-Acetylserine 7.8 146.04579 N-Acetyltryptophan 2.765 245.09309 N-Acetyl-valine 2.445 158.08214 N-.alpha.-Acetyl-L-ornithine 8.522 173.09273 N-epsilon-Acetyllysine 8.085 187.1088 N-Formylmethionine 3.903 176.03848 Nicotinic acid 3.904 122.02466 N-Isobutyrylglycine 3.607 144.06651 N-Methylglutamic acid 8.509 160.06139 N,N-Dimethylarginine 8.97 201.13547 Nobiletin 8.647 401.12946 N-omega-Acetylhistamine 6.007 152.08247 OPHTHALMIC ACID 8.979 288.11981 Ornithine 9.507 131.08244 Orotic acid 7.428 155.00978 o-Tyrosine 7.19 180.06619 P-Anisic acid 1.15 151.03981 Phe-Ala 7.289 235.10832 Phe-Asp 7.839 279.09778 Phe-Glu 7.872 293.11438 Phe-Gly 7.628 221.09306 Phe-His 8.579 301.12979 Phe-Leu 5.682 277.15491 Phe-Phe 5.801 311.13956 Phe-Thr 7.611 265.11938 Phe-Trp 5.863 350.15039 Phe-Val 6.135 263.13934 Phosphoric acid 9.999 96.95995 Phosphoserine 9.885 184.00137 Pimelic acid 1.78 159.06607 Pro-Ala 7.917 185.09254 Pro-Asn 8.852 228.09839 Pro-Asp 8.571 229.08276 Pro-Gln 8.668 242.11443 Pro-Glu 8.481 243.09834 Pro-Gly 8.272 171.07712 Proline 7.805 114.05573 Propenyl sulfate (?) 3.217 136.9912 Pro-Phe 7.012 261.12372 Pro-Pro 7.873 211.10837 Pro-Ser 8.615 201.08762 Pro-Val 7.66 213.12387 Pseudouridine 7.025 243.06227 Psicose 5.992 179.0556 Pterine 5.283 162.04196 Purine 2.418 119.03625 Pyridoxal 2.354 166.0504 Pyridoxine 3.419 168.06636 PyroGlu-Trp 5.969 314.1145 Pyrrole-2-carboxylic acid 1.543 110.02448 Pyruvic acid 5.249 87.00854 Ribose 1-phosphate 9.236 229.01173 S-Adenosyl-homocysteine 8.788 383.11435 Salicylic alcohol 2.713 123.04486 S-Carboxymethyl-L-cysteine 8.989 178.01743 Sebacic acid 1.393 201.11308 Ser-Arg 9.858 260.12457 Ser-Asn 9.545 218.07761 Ser-Asp 9.395 219.0616 Ser-Gln 9.42 232.09326 Ser-Glu 9.292 233.07791 Ser-Gly 9.181 161.05637 Ser-His 9.793 241.09361 Serine 8.671 104.03518 Ser-Lys 9.865 232.12965 Ser-Met 8.099 235.07576 Ser-Ser 9.421 191.06682 Ser-Tyr 8.359 267.09793 Ser-Val 8.112 203.10365 Sorbitol 7.799 181.07135 S-Sulfocysteine 8.043 199.96921 Suberic acid 1.613 173.08154 Succinic acid 4.062 117.01919 Sucrose 8.43 341.108 Sulfoacetic acid 8.299 138.97043 Taurine 7.798 124.00718 Thr-Ala 8.49 189.08751 Thr-Asp 9.127 233.07726 Threonic acid 9.555 135.02974 Threonine 8.175 118.0509 Thr-Gln 9.185 246.1089 Thr-Glu 9.176 247.09332 Thr-Gly 8.827 175.07181 Thr-Gly-Thr 9.027 276.11996 Thr-His 9.636 255.10927 Thr-Lys 9.727 246.14575 Thr-Phe 7.483 265.11884 Thr-Pro 8.245 215.10318 Thr-Ser 9.153 205.08235 Thr-Thr 8.823 219.09795 Thr-Tyr 7.985 281.11362 Thr-Val 7.8 217.11871 Thr-Val-Leu 7.042 330.2027 Thymidine 2.705 241.08304 Thymidine-5'-monophosphate 8.417 321.06296 Thymine 2.133 125.03555 trans-4-Hydroxy-L-proline 8.083 130.05064 Trehalose-6-Phosphate 10.091 421.07513 Trp-Gly 7.541 260.10333 Trp-Ile 6.076 316.16568 Trp-Val 6.49 302.1503 Tryptophan 6.869 203.08237 Tyr-Asp 8.373 295.09341 Tyr-Gln 8.482 308.12494 Tyr-His 9.28 317.12454 Tyr-Ile 6.795 293.1499 Tyr-Pro 7.444 277.11865 Tyr-Ser 8.112 267.09787 Tyr-Thr 8.1 281.11417 Tyr-Val 7.295 279.13422 Uridine 4.941 243.062 Uridine 5'-monophosphate 9.126 323.02841 Urocanic acid 3.571 137.03531 Val-Arg 9.255 272.172 Val-Asn 8.583 230.11388 Val-Asp 8.338 231.09842 Val-Gln 8.435 244.12994 Val-Glu 8.306 245.11406 Val-His 9.162 253.12996 Valine 7.796 116.07144 Val-Leu 6.804 229.15559 Val-Lys 9.337 244.16599 Val-Met 7.283 247.11154 Val-Phe 6.684 263.13983 Val-Ser 8.369 203.10316 Val-Trp 6.676 302.15076 Val-Tyr 7.545 279.13489 Val-Val 7.395 215.13982 Vanillic acid 1.256 167.03482 Xanthine 5.642 151.02602 Xanthosine 7.404 283.07828 METABOLITES_END #END