#METABOLOMICS WORKBENCH yohei57jp_20241209_024819 DATATRACK_ID:5446 STUDY_ID:ST003627 ANALYSIS_ID:AN005959 PROJECT_ID:PR002240 VERSION 1 CREATED_ON December 12, 2024, 5:32 pm #PROJECT PR:PROJECT_TITLE Lipidomic analysis of human regulatory T cells. PR:PROJECT_SUMMARY Regulatory T cells (Tregs) are characterized by stable FOXP3 expression and PR:PROJECT_SUMMARY controlling immune response by suppressive activity. Unique metabolic properties PR:PROJECT_SUMMARY of Tregs are shown such as reduced glycolysis and increased oxidative PR:PROJECT_SUMMARY phosphorylation. We have combined transcriptomics, metabolomics and lipidomics PR:PROJECT_SUMMARY to dissect metabolic dynamics of Tregs upon activation. Combined metabolomic and PR:PROJECT_SUMMARY lipidomic analysis showed that freshly isolated Tregs have unique metabolomic PR:PROJECT_SUMMARY property, on the other hand, activated Tregs have unique lipidomic property. PR:PROJECT_SUMMARY Interestingly, activated Tregs contained omega-3 polyunsaturated fatty acids PR:PROJECT_SUMMARY (PUFA) enriched diglycerides and triglycerides. PR:INSTITUTE The Jikei University School of Medicine PR:LAST_NAME Sato PR:FIRST_NAME Yohei PR:ADDRESS 3-25-8 Nishishinbashi, Minato-ku, Tokyo, 1058461, Japan PR:EMAIL yoheisatoo@gmail.com PR:PHONE +81-3-3433-1111 #STUDY ST:STUDY_TITLE Lipidomic analysis of human regulatory T cells. ST:STUDY_SUMMARY Regulatory T cells (Tregs) are characterized by stable FOXP3 expression and ST:STUDY_SUMMARY controlling immune response by suppressive activity. Unique metabolic properties ST:STUDY_SUMMARY of Tregs are shown such as reduced glycolysis and increased oxidative ST:STUDY_SUMMARY phosphorylation. We have combined transcriptomics, metabolomics and lipidomics ST:STUDY_SUMMARY to dissect metabolic dynamics of Tregs upon activation. Combined metabolomic and ST:STUDY_SUMMARY lipidomic analysis showed that freshly isolated Tregs have unique metabolomic ST:STUDY_SUMMARY property, on the other hand, activated Tregs have unique lipidomic property. ST:STUDY_SUMMARY Interestingly, activated Tregs contained omega-3 polyunsaturated fatty acids ST:STUDY_SUMMARY (PUFA) enriched diglycerides and triglycerides. ST:INSTITUTE The Jikei University School of Medicine ST:LAST_NAME Sato ST:FIRST_NAME Yohei ST:ADDRESS 3-25-8 Nishishinbashi, Minato-ku, Tokyo, 1058461, Japan ST:EMAIL yoheisatoo@gmail.com ST:PHONE +81-3-3433-1111 #SUBJECT SU:SUBJECT_TYPE Human SU:SUBJECT_SPECIES Homo sapiens SU:TAXONOMY_ID 9606 #SUBJECT_SAMPLE_FACTORS: SUBJECT(optional)[tab]SAMPLE[tab]FACTORS(NAME:VALUE pairs separated by |)[tab]Raw file names and additional sample data SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - Teff1 Group:Teff | Sample source:- SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - Teff2 Group:Teff | Sample source:- SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - Teff3 Group:Teff | Sample source:- SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - Treg1 Group:Treg | Sample source:- SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - Treg2 Group:Treg | Sample source:- SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - Treg3 Group:Treg | Sample source:- SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - Activated Teff1 Group:Activated Teff | Sample source:- SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - Activated Teff2 Group:Activated Teff | Sample source:- SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - Activated Teff3 Group:Activated Teff | Sample source:- SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - Activated Treg1 Group:Activated Treg | Sample source:- SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - Activated Treg2 Group:Activated Treg | Sample source:- SUBJECT_SAMPLE_FACTORS - Activated Treg3 Group:Activated Treg | Sample source:- #COLLECTION CO:COLLECTION_SUMMARY Human regulatory T cells were sorted according to the CD4+CD25+CD127- CO:COLLECTION_SUMMARY populations by flow cytometry. Human effector T cells were sorted according to CO:COLLECTION_SUMMARY the CD4+CD25-CD127+ populations by flow cytometry. Cells were directly sorted in CO:COLLECTION_SUMMARY RPMI medium supplemented with 10% FBS. Spin down the collected cells and cell CO:COLLECTION_SUMMARY pellets were stored at -80C. CO:SAMPLE_TYPE T-cells #TREATMENT TR:TREATMENT_SUMMARY Human regulatory T cells were sorted and activated overnight by CD3/CD28/CD2 TR:TREATMENT_SUMMARY stimulation in the presence of 100U/ml recombinant human IL-2. #SAMPLEPREP SP:SAMPLEPREP_SUMMARY Briefly, methanol was added to the frozen cell pellets to prepare a cell SP:SAMPLEPREP_SUMMARY suspension. Total lipids were extracted from the entire suspension (equivalent SP:SAMPLEPREP_SUMMARY to 1 x 10-6 cells) using the Bligh & Dyer method (partially modified), a SP:SAMPLEPREP_SUMMARY liquid-liquid distribution method using chloroform, methanol, water, etc. The SP:SAMPLEPREP_SUMMARY extracted lipid fraction was dried with nitrogen gas, then redissolved in 1 mL SP:SAMPLEPREP_SUMMARY of methanol and transferred to a measurement vial for analysis. #CHROMATOGRAPHY CH:CHROMATOGRAPHY_TYPE Other CH:INSTRUMENT_NAME Thermo Dionex Ultimate 3000 CH:COLUMN_NAME L-column3 C18 Metal Free Column 2.0 x 100 mm, 2.0 um, CERI CH:SOLVENT_A 2-Propanolol:Methanol:Water=5:1:4, 5mM Ammonium Formate, 0.05% Ammonium CH:SOLVENT_A hydroxide CH:SOLVENT_B 2-Propanolol, 5mM Ammonium Formate, 0.05% Ammonium hydroxide CH:FLOW_GRADIENT Mobile phase A (isopropanol/methanol/water (5/1/4 v/v/v) supplemented with 5 mM CH:FLOW_GRADIENT ammonium formate and 0.05% ammonium hydroxide (28% in water))/mobile phase B CH:FLOW_GRADIENT (isopropanol supplemented with 5 mM ammonium formate and 0.05% ammonium CH:FLOW_GRADIENT hydroxide (28% in water)) ratios of 60%/40% (0 min), 40%/60% (0-1 min), 20%/80% CH:FLOW_GRADIENT (1-9 min), 5%/95% (9-11 min), 5%/95% (11-22 min), 95%/5% (22-22.1 min), 95%/5% CH:FLOW_GRADIENT (22.1-25 min), 60%/40% (25-25.1 min) and 60%/40% (25.1-30 min). CH:FLOW_RATE 0.1 ml/min CH:COLUMN_TEMPERATURE 40 #ANALYSIS AN:ANALYSIS_TYPE MS #MS MS:INSTRUMENT_NAME Thermo Q Exactive Plus Orbitrap MS:INSTRUMENT_TYPE Orbitrap MS:MS_TYPE ESI MS:ION_MODE NEGATIVE MS:MS_COMMENTS LC-ESI/MS/MS. The lipid identification analysis software Lipid Search 5. 1 MS:MS_COMMENTS (Mitsui Knowledge Industry Co., Ltd.) was used to identify lipid molecular MS:MS_COMMENTS species and align the measured samples. Correction value was calculated by MS:MS_COMMENTS following method (Total area correction). Correlation value = (Area value of MS:MS_COMMENTS detected peak) divided by (Total area value of detected peaks). A comprehensive MS:MS_COMMENTS lipidome analysis was performed on the received samples using IC-ESIMS/MS. The MS:MS_COMMENTS m/z values obtained and fragment ions were compared with the database registered MS:MS_COMMENTS in Lipid Search, and the number of molecular species that met the adoption MS:MS_COMMENTS criteria (our non-disclosed indicators) was 23 classes, 611 molecular species. MS:MS_COMMENTS The peak area of each identified molecule was corrected by the total area value MS:MS_COMMENTS (the sum of the detected area values). In addition, the relative values were MS:MS_COMMENTS used to correct the peak area. #MS_METABOLITE_DATA MS_METABOLITE_DATA:UNITS arbitrary units MS_METABOLITE_DATA_START Samples Teff1 Teff2 Teff3 Treg1 Treg2 Treg3 Activated Teff1 Activated Teff2 Activated Teff3 Activated Treg1 Activated Treg2 Activated Treg3 Factors Group:Teff | Sample source:- Group:Teff | Sample source:- Group:Teff | Sample source:- Group:Treg | Sample source:- Group:Treg | Sample source:- Group:Treg | Sample source:- Group:Activated Teff | Sample source:- Group:Activated Teff | Sample source:- Group:Activated Teff | Sample source:- Group:Activated Treg | Sample source:- Group:Activated Treg | Sample source:- Group:Activated Treg | Sample source:- CL(18:2_18:2_18:2_18:2) 1.43.E-04 1.32.E-04 1.12.E-04 1.22.E-04 1.20.E-04 6.97.E-05 7.63.E-05 1.05.E-04 1.02.E-04 6.44.E-05 1.02.E-04 1.07.E-04 FA(18:0) 2.17.E-04 2.50.E-04 2.31.E-04 2.42.E-04 2.28.E-04 1.81.E-04 2.60.E-04 2.69.E-04 2.44.E-04 2.52.E-04 2.21.E-04 3.60.E-04 FA(18:1) 5.49.E-04 3.56.E-04 3.11.E-04 5.12.E-04 6.60.E-04 4.69.E-04 3.50.E-04 4.20.E-04 3.43.E-04 3.13.E-04 4.10.E-04 5.54.E-04 FA(18:2) 9.16.E-05 9.39.E-05 8.28.E-05 1.11.E-04 1.65.E-04 8.39.E-05 1.11.E-04 1.54.E-04 8.63.E-05 1.03.E-04 8.83.E-05 1.16.E-04 FA(20:1) 7.48.E-06 9.02.E-06 8.13.E-06 1.07.E-05 8.93.E-06 9.09.E-06 9.99.E-06 9.44.E-06 8.92.E-06 8.26.E-06 8.86.E-06 1.16.E-05 FA(20:4) 5.70.E-04 4.08.E-04 4.30.E-04 6.41.E-04 6.39.E-04 4.85.E-04 4.42.E-04 5.20.E-04 3.93.E-04 4.18.E-04 4.19.E-04 4.62.E-04 FA(22:4) 1.95.E-05 1.62.E-05 1.55.E-05 2.35.E-05 2.48.E-05 2.31.E-05 2.85.E-05 3.13.E-05 3.81.E-05 4.92.E-05 2.97.E-05 3.55.E-05 FA(22:5) 1.41.E-04 8.64.E-05 7.80.E-05 1.53.E-04 1.42.E-04 1.02.E-04 1.26.E-04 1.37.E-04 1.03.E-04 1.23.E-04 1.36.E-04 1.29.E-04 FA(22:6) 5.01.E-04 3.84.E-04 3.12.E-04 5.42.E-04 8.54.E-04 4.03.E-04 5.64.E-04 6.02.E-04 3.65.E-04 5.12.E-04 4.02.E-04 4.77.E-04 GM3(d34:1) 4.26.E-05 3.23.E-05 4.33.E-05 4.54.E-05 3.41.E-05 3.30.E-05 3.38.E-05 3.97.E-05 4.10.E-05 3.42.E-05 4.86.E-05 4.65.E-05 GM3(d36:1) 1.77.E-05 1.93.E-05 2.01.E-05 1.99.E-05 1.75.E-05 1.45.E-05 1.72.E-05 1.53.E-05 1.67.E-05 1.32.E-05 2.03.E-05 1.57.E-05 GM3(d40:1) 2.67.E-05 2.21.E-05 3.03.E-05 2.57.E-05 1.99.E-05 2.21.E-05 1.59.E-05 2.16.E-05 1.91.E-05 2.44.E-05 2.45.E-05 2.59.E-05 GM3(d42:2) 4.64.E-05 4.21.E-05 4.98.E-05 4.78.E-05 4.48.E-05 3.69.E-05 5.20.E-05 4.44.E-05 4.19.E-05 5.03.E-05 5.74.E-05 5.46.E-05 LBPA(18:1_18:1) 3.80.E-05 2.76.E-05 3.01.E-05 3.38.E-05 3.50.E-05 2.63.E-05 3.07.E-05 1.58.E-05 9.38.E-06 2.14.E-05 1.20.E-05 1.55.E-05 LBPA(18:1_18:2) 2.43.E-05 1.67.E-05 1.51.E-05 2.37.E-05 1.99.E-05 1.23.E-05 2.08.E-05 2.41.E-05 2.26.E-05 2.21.E-05 2.62.E-05 3.10.E-05 LPC(14:0) 5.00.E-05 3.35.E-05 2.82.E-05 5.04.E-05 5.50.E-05 2.67.E-05 4.70.E-05 5.09.E-05 4.30.E-05 4.79.E-05 3.87.E-05 4.46.E-05 LPC(16:0) 2.58.E-03 2.05.E-03 2.16.E-03 2.83.E-03 2.79.E-03 1.77.E-03 2.04.E-03 2.14.E-03 2.04.E-03 2.02.E-03 1.75.E-03 2.05.E-03 LPC(16:1) 1.79.E-04 1.57.E-04 1.14.E-04 1.84.E-04 2.32.E-04 1.02.E-04 1.84.E-04 1.84.E-04 1.59.E-04 1.72.E-04 1.44.E-04 1.62.E-04 LPC(17:0) 1.54.E-04 1.18.E-04 1.22.E-04 1.61.E-04 1.77.E-04 1.13.E-04 1.38.E-04 1.18.E-04 1.12.E-04 1.15.E-04 1.01.E-04 1.10.E-04 LPC(17:1) 7.05.E-05 6.62.E-05 4.85.E-05 8.10.E-05 7.53.E-05 4.45.E-05 6.52.E-05 6.80.E-05 6.26.E-05 6.04.E-05 5.35.E-05 5.94.E-05 LPC(18:0) 2.19.E-03 1.47.E-03 1.68.E-03 2.17.E-03 2.30.E-03 1.56.E-03 1.66.E-03 1.42.E-03 1.50.E-03 1.45.E-03 1.16.E-03 1.20.E-03 LPC(18:1) 2.09.E-03 1.47.E-03 1.31.E-03 2.08.E-03 2.00.E-03 1.19.E-03 1.54.E-03 1.55.E-03 1.40.E-03 1.40.E-03 1.27.E-03 1.45.E-03 LPC(18:2) 3.37.E-04 2.67.E-04 2.38.E-04 3.24.E-04 3.13.E-04 1.87.E-04 1.61.E-04 1.73.E-04 1.58.E-04 1.62.E-04 1.48.E-04 1.65.E-04 LPC(19:0) 6.83.E-05 4.61.E-05 4.78.E-05 6.01.E-05 5.63.E-05 4.66.E-05 4.30.E-05 2.57.E-05 3.44.E-05 3.82.E-05 2.34.E-05 2.62.E-05 LPC(19:1) 3.32.E-05 2.35.E-05 1.99.E-05 2.78.E-05 3.10.E-05 1.85.E-05 2.50.E-05 2.28.E-05 2.30.E-05 2.50.E-05 2.00.E-05 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