#METABOLOMICS WORKBENCH purdylab_20250609_140328 DATATRACK_ID:6018 STUDY_ID:ST003999 ANALYSIS_ID:AN006594 PROJECT_ID:PR002504 VERSION 1 CREATED_ON 06-25-2025 #PROJECT PR:PROJECT_TITLE Measuring PEMT activity in HCMV infected fibroblasts using 13C-methionine. PR:PROJECT_SUMMARY Human cytomegalovirus (HCMV) is a common herpesvirus that establishes a lifelong PR:PROJECT_SUMMARY and persistent infection in its human host. HCMV infection in most people does PR:PROJECT_SUMMARY not cause overt disease. However, in immunocompromised individuals, severe PR:PROJECT_SUMMARY CMV-associated disease can lead to permanent disabilities and even death. PR:PROJECT_SUMMARY Additionally, congenital CMV is the leading infectious cause of birth defects. PR:PROJECT_SUMMARY Viruses have evolved to hijack host metabolic pathways to facilitate their PR:PROJECT_SUMMARY replication cycle. We previously reported HCMV infection increases PR:PROJECT_SUMMARY phosphatidylcholine (PC) lipid levels, including PCs with VLCFAs. To expand upon PR:PROJECT_SUMMARY the previously reported PC phenotype in HCMV infection, we determined the PC PR:PROJECT_SUMMARY lipidome of several infected cell types grown under various growth conditions. PR:PROJECT_SUMMARY Additionally, we determined which host pathways HCMV reprograms to induce PC PR:PROJECT_SUMMARY lipid synthesis and describe when during infection PC lipids changes occur. PR:INSTITUTE University of Arizona PR:DEPARTMENT Immunobiology PR:LABORATORY John G. Purdy, PhD PR:LAST_NAME Kline PR:FIRST_NAME Ian PR:ADDRESS 1657 E Helen St, Tucson, AZ 85721 PR:EMAIL ikline@arizona.edu PR:PHONE 5209092596 PR:FUNDING_SOURCE National Institute of Health (NIH) National Institute of Allergy and Infectious PR:FUNDING_SOURCE Disease (NIAID) R01AI162671, R01AI155539, F32AI178919, and National Institute of PR:FUNDING_SOURCE Aging (NIA) T32AG058503 award. PR:DOI http://dx.doi.org/10.21228/M8ZV87 #STUDY ST:STUDY_TITLE Measuring PEMT activity in HCMV infected fibroblasts using 13C-methionine. ST:STUDY_SUMMARY HCMV promotes the levels of PC lipids in infection. The Kennedy pathway is the ST:STUDY_SUMMARY canonical host pathway for de novo PC lipid synthesis. Host cells encode ST:STUDY_SUMMARY alternative pathways for PC synthesis such as the Phosphatidylethanolamine ST:STUDY_SUMMARY N-methyltransferase (PEMT) pathway. Here, we tested if HCMV promotes metabolic ST:STUDY_SUMMARY activity in the PEMT pathway. We used 13C-methionine to track the metabolism of ST:STUDY_SUMMARY labeled tracer molecule into the head group of PC lipids thus, measuring PEMT ST:STUDY_SUMMARY pathway activity. We find that HCMV and uninfected cells exhibit similarly low ST:STUDY_SUMMARY PEMT metabolic activity and percentage of labeled PCs. Moreover, when cells were ST:STUDY_SUMMARY engineered to overexpress the host PEMT enzyme, PC labeling via PEMT increased ST:STUDY_SUMMARY when expression was induced with doxycycline. Overexpressing GFP and feeding ST:STUDY_SUMMARY labeled molecule resulted in labeling similar to mock and infected labeling ST:STUDY_SUMMARY percentages, <5%. Thus, PEMT is not an active pathway in the primary human ST:STUDY_SUMMARY fibroblasts used in our studies and HCMV infection does not increase metabolic ST:STUDY_SUMMARY activity of PEMT to synthesize PCs. ST:INSTITUTE University of Arizona ST:DEPARTMENT Immunobiology ST:LABORATORY John G. Purdy, PhD ST:LAST_NAME Kline ST:FIRST_NAME Ian ST:ADDRESS 1657 E Helen St, Tucson, AZ 85721 ST:EMAIL ikline@arizona.edu ST:PHONE 5209092596 ST:SUBMIT_DATE 2025-06-09 #SUBJECT SU:SUBJECT_TYPE Cultured cells SU:SUBJECT_SPECIES Homo sapiens SU:TAXONOMY_ID 9606 SU:GENDER Male SU:CELL_STRAIN_DETAILS HFF SU:CELL_PASSAGE_NUMBER <30 #SUBJECT_SAMPLE_FACTORS: SUBJECT(optional)[tab]SAMPLE[tab]FACTORS(NAME:VALUE pairs separated by |)[tab]Additional sample data SUBJECT_SAMPLE_FACTORS PEMT_control_pos_pLV-GFP_1ug_dox_24_a 20230316_pos_24hpi_pLV-GFP_1ug_a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):24 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:GFP | Doxycycline:1ug/mL Isotopic label=13C-methionine; RAW_FILE_NAME(.mzxML file name)=20230316_pos_24hpi_pLV-GFP_1ug_a SUBJECT_SAMPLE_FACTORS PEMT_control_pos_pLV-GFP_1ug_dox_24_b 20230316_pos_24hpi_pLV-GFP_1ug_b Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):24 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:GFP | Doxycycline:1ug/mL Isotopic label=13C-methionine; 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Avoid contact with plastic caps, CO:COLLECTION_SUMMARY tubes and gloves around glass vial tops. -Work in manageable batch numbers. A CO:COLLECTION_SUMMARY batch of 8-16 samples at a time is common. -Clean syringes using chloroform CO:COLLECTION_SUMMARY before and after collection. Use a unique syringe for each sample (the same CO:COLLECTION_SUMMARY syringe can be used if A/B technical replicates are used. Recommend a quick CO:COLLECTION_SUMMARY flush of the syringe using 500 μL chloroform before moving from A to B). Begin CO:COLLECTION_SUMMARY by counting cell numbers for each sample using a dedicated well meant for MS CO:COLLECTION_SUMMARY normalization based on cell count. In a 6-well plate, wash cells 2x with cold CO:COLLECTION_SUMMARY PBS. Add 1 mL of cold 50% methanol to each well and scrape cells into glass CO:COLLECTION_SUMMARY vials. Add 500 μL of chloroform. Vortex on low setting (careful to avoid CO:COLLECTION_SUMMARY splashing chloroform onto plastic caps and liners). Centrifuge @1000g for 5 CO:COLLECTION_SUMMARY mins. There should be a clear phase separation of methanol and cell debris on CO:COLLECTION_SUMMARY top, while the lower phase contains chloroform and lipids. Use a syringe to CO:COLLECTION_SUMMARY carefully extract the lower phase without transferring cell debris from the top CO:COLLECTION_SUMMARY layer. Transfer to clean vial and place on ice. Once all lipids have been CO:COLLECTION_SUMMARY extracted, add 500 μL of chloroform and repeat the process again once more. In CO:COLLECTION_SUMMARY total each sample should contain ~1 mL of chloroform and lipids from two CO:COLLECTION_SUMMARY extractions. Carefully, dry lipids under nitrogen gas. Avoid direct high CO:COLLECTION_SUMMARY pressure air flow onto chloroform:lipid solution as it can splash high up in CO:COLLECTION_SUMMARY vial walls. Store at -80℃ for up to 30 days. Samples may become unstable and CO:COLLECTION_SUMMARY degrade over time. CO:SAMPLE_TYPE Cultured cells CO:COLLECTION_LOCATION Fume hood required when working with chloroform. CO:COLLECTION_FREQUENCY Perform extraction twice on each sample. CO:COLLECTION_DURATION 1-2 hours dependent upon batch size CO:VOLUMEORAMOUNT_COLLECTED ~1 mL chloroform:lipid soluition CO:STORAGE_CONDITIONS -80℃ CO:COLLECTION_VIALS Glass vials, no plastic! (plastic cap is okay) CO:STORAGE_VIALS Glass vials, no plastic! (plastic cap is okay) CO:COLLECTION_TUBE_TEMP 25 CO:ADDITIVES UHPLC 100% chloroform #TREATMENT TR:TREATMENT_SUMMARY Cells were grown to full confluence and held for 3-days in Dulbecco's modified TR:TREATMENT_SUMMARY eagle medium (DMEM) with 10% fetal bovine serum (FBS). 24 hours prior to TR:TREATMENT_SUMMARY infection, cells were starved of serum in DMEM lacking FBS. Cells were TR:TREATMENT_SUMMARY HCMV-infected or mock-infected in serum-free DMEM for 1 hour. 1 hpi, TR:TREATMENT_SUMMARY 13C-methionine isotopic tracer was fed to cells in serum-free growth medium we TR:TREATMENT_SUMMARY previously prepared (based on the published DMEM Gibco recipe). Tracer media TR:TREATMENT_SUMMARY contains 13C-methionine in place 12C-methionine. Tracer molecule was added at TR:TREATMENT_SUMMARY the same concentration non-tracer molecule is normally present in DMEM TR:TREATMENT_SUMMARY (13C-methionine (30mg/L)). Medium was replaced at 48 hpi. #SAMPLEPREP SP:SAMPLEPREP_SUMMARY Before starting, calculate the volume of 1:1:1 choloroform:methanol:isopropanol SP:SAMPLEPREP_SUMMARY resuspension buffer needed for each sample. Volume of 1:1:1 is dependent on SP:SAMPLEPREP_SUMMARY normalize cell count from experiment. Use 200uL of 1:1:1 for every 2E5 cells. SP:SAMPLEPREP_SUMMARY When ready to start resuspension, remove dried lipids from -80C storage and SP:SAMPLEPREP_SUMMARY resuspend in volume of 1:1:1 solution calculated for each sample. No cell SP:SAMPLEPREP_SUMMARY conditions use 200uL. Use gentle vortex to allow for dried lipids from vial wall SP:SAMPLEPREP_SUMMARY to get into solution. Prepare "blank" vials of 1:1:1 for buffer background SP:SAMPLEPREP_SUMMARY analysis. Store lipids in autosampler between 4-7C. #CHROMATOGRAPHY CH:INSTRUMENT_NAME Thermo Vanquish CH:COLUMN_NAME Phenomenex Kinetex C18 (100 x 2.1mm,2.6um) CH:COLUMN_TEMPERATURE 60℃ CH:FLOW_GRADIENT 75% solvent A–25% solvent B for 2 min, 35% solvent A–65% solvent B for 2min CH:FLOW_GRADIENT at a curve value of 4, a hold at 35% solvent A–65% solvent B for 1min, 0% CH:FLOW_GRADIENT solvent A–100% solvent B for 11min at a curve value of 4, and a hold at 0% CH:FLOW_GRADIENT solvent A–100% solvent B for 4 min. CH:FLOW_RATE 0.25 mL/min CH:SOLVENT_A 40% Water/60% Methanol; 10mM Ammonium formate; 0.1% Formic acid CH:SOLVENT_B 10% Methanol/90% Isopropanol; 10mM Ammonium formate; 0.1% Formic acid CH:CHROMATOGRAPHY_TYPE Reversed phase #ANALYSIS AN:ANALYSIS_TYPE MS AN:ANALYSIS_PROTOCOL_FILE Cambridge_isotope_13C-methionine_MSDS.pdf #MS MS:INSTRUMENT_NAME Thermo Orbitrap Exploris 240 MS:INSTRUMENT_TYPE Orbitrap MS:MS_TYPE ESI MS:MS_COMMENTS PCs were identified in positive mode using parent lipid m/z, RT and choline head MS:MS_COMMENTS fragment of 184.073 m/z. Confirmation of PCs was performed by FA tail analysis MS:MS_COMMENTS in negative mode. PCs containing 1-3 13C atoms were included in the PEMT pathway MS:MS_COMMENTS analysis. The percent labeling was calculated as a fraction of the sum of 1-, MS:MS_COMMENTS 2-, and 3-labeled PC relative to the total PC level. MS:ION_MODE POSITIVE #MS_METABOLITE_DATA MS_METABOLITE_DATA:UNITS Peak Area MS_METABOLITE_DATA_START Samples 20230316_pos_24hpi_pLV-GFP_1ug_a 20230316_pos_24hpi_pLV-GFP_1ug_b 20230316_pos_24hpi_pLV-PEMT_1ug_a 20230316_pos_24hpi_pLV-PEMT_1ug_b 20230806_13C-methionine_pos_TB40E_choline_48_a 20230806_13C-methionine_pos_TB40E_choline_48_b 20230905_13C_methionine_pos_choline_TB40E_48_a 20230905_13C_methionine_pos_choline_TB40E_48_b 20231007_13C-methionine_pos_TB40E_48_a 20231007_13C-methionine_pos_TB40E_48_b 20230905_13C_methionine_pos_GFP_1ug_48_a 20230905_13C_methionine_pos_GFP_1ug_48_b 20230806_13C-methionine_pos_mock_choline_48_a 20230806_13C-methionine_pos_mock_choline_48_b 20230905_13C_methionine_pos_choline_mock_48_a 20230905_13C_methionine_pos_choline_mock_48_b 20231007_13C-methionine_pos_mock_48_a 20231007_13C-methionine_pos_mock_48_b 20230905_13C_methionine_pos_PEMT_1ug_48_a 20230905_13C_methionine_pos_PEMT_1ug_48_b 20230316_pos_6hpi_pLV-GFP_1ug_a 20230316_pos_6hpi_pLV-GFP_1ug_b 20230316_pos_6hpi_pLV-PEMT_1ug_a 20230316_pos_6hpi_pLV-PEMT_1ug_b 20230806_13C-methionine_pos_TB40E_choline_72_a 20230806_13C-methionine_pos_TB40E_choline_72_b 20230905_13C_methionine_pos_choline_TB40E_72_a 20230905_13C_methionine_pos_choline_TB40E_72_b 20231007_13C-methionine_pos_TB40E_72_a 20231007_13C-methionine_pos_TB40E_72_b 20231007_13C-methionine_pos_mock_72_a 20230316_pos_72hpi_pLV-GFP_1ug_a 20230316_pos_72hpi_pLV-GFP_1ug_b 20230905_13C_methionine_pos_GFP_1ug_72_a 20230905_13C_methionine_pos_GFP_1ug_72_b 20230806_13C-methionine_pos_mock_choline_72_a 20230806_13C-methionine_pos_mock_choline_72_b 20230905_13C_methionine_pos_choline_mock_72_a 20230905_13C_methionine_pos_choline_mock_72_b 20231007_13C-methionine_pos_mock_72_b 20230316_pos_72hpi_pLV-PEMT_1ug_a 20230316_pos_72hpi_pLV-PEMT_1ug_b 20230905_13C_methionine_pos_PEMT_1ug_72_a 20230905_13C_methionine_pos_PEMT_1ug_72_b Factors Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):24 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:GFP | Doxycycline:1ug/mL Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):24 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:GFP | Doxycycline:1ug/mL Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):24 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:PEMT | Doxycycline:1ug/mL Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):24 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:PEMT | Doxycycline:1ug/mL Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):48 | Infection status:HCMV | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):48 | Infection status:HCMV | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):48 | Infection status:HCMV | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):48 | Infection status:HCMV | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):48 | Infection status:HCMV | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):48 | Infection status:HCMV | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):48 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:GFP | Doxycycline:1ug/mL Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):48 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:GFP | Doxycycline:1ug/mL Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):48 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):48 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):48 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):48 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):48 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):48 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):48 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:PEMT | Doxycycline:1ug/mL Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):48 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:PEMT | Doxycycline:1ug/mL Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):6 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:GFP | Doxycycline:1ug/mL Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):6 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:GFP | Doxycycline:1ug/mL Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):6 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:PEMT | Doxycycline:1ug/mL Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):6 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:PEMT | Doxycycline:1ug/mL Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):72 | Infection status:HCMV | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):72 | Infection status:HCMV | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):72 | Infection status:HCMV | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):72 | Infection status:HCMV | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):72 | Infection status:HCMV | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):72 | Infection status:HCMV | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):72 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:- | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):72 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:GFP | Doxycycline:1ug/mL Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):72 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:GFP | Doxycycline:1ug/mL Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):72 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:GFP | Doxycycline:1ug/mL Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):72 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:GFP | Doxycycline:1ug/mL Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):72 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):72 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):72 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):72 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):72 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:n/a | Doxycycline:n/a Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):72 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:PEMT | Doxycycline:1ug/mL Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):72 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:PEMT | Doxycycline:1ug/mL Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):72 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:PEMT | Doxycycline:1ug/mL Sample source:Primary human fibroblast cells (HFF) | Time (hpi):72 | Infection status:Uninfected | Inducible gene:PEMT | Doxycycline:1ug/mL PC 28:1 C12 PARENT 5065892.0000 4505762.0000 3889152.0000 4639730.0000 4915810.0000 21784510.0000 1520915.0000 1492729.0000 1325131.0000 1000435.0000 355829.0000 383411.0000 16681740.0000 21149590.0000 3591724.0000 5095420.0000 6972274.0000 6790382.0000 255314.0000 289216.0000 2068251.0000 2129962.0000 1459062.0000 1709244.0000 28892970.0000 15847.0000 3048558.0000 2920457.0000 2016068.0000 2161493.0000 9545025.0000 10287230.0000 413395.0000 318813.0000 21814230.0000 18190000.0000 5439744.0000 5119658.0000 8095890.0000 8575725.0000 9038120.0000 350439.0000 245166.0000 PC 28:1 C13-label-1 1906583.0000 1821114.0000 1669214.0000 2014066.0000 1939953.0000 8270176.0000 654703.0000 564886.0000 544267.3000 412628.3000 158817.0000 153595.0000 6742648.0000 8781175.0000 1443140.0000 2078370.0000 2621493.0000 2699152.0000 81930.0000 114299.0000 784272.0000 870912.0000 661721.0000 700619.0000 11509920.0000 1201830.0000 1157145.0000 749127.5000 865326.8000 4147769.0000 4160177.0000 162134.0000 125902.0000 8803587.0000 7029442.0000 2167899.0000 2019939.0000 3158321.0000 3436328.0000 3672364.0000 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